Ensaio imunoenzimático para o diagnóstico da hepatite A utilizando IgY anti-HAV / Immunosorbent assay for diagnosis of hepatitis A using the IgY anti-HAV

RESUMO

A hepatite A é uma doença endêmica no Brasil e na América Latina. A prevalência da infecção tem correlação com precárias condições de higiene e saneamento. Em países em desenvolvimento, um saneamento inadequado resulta em maior transmissão desta doença, principalmente entre crianças e jovens. Atualmente, devido às melhorias das condições sanitárias, o perfil epidemiológico da doença está se deslocando para idades mais avançadas, o que facilita a ocorrência de surtos epidemiológicos. Os kits comerciais para detecção de anti-HAV total normalmente utilizam imunoglobulina G (IgG) de mamíferos no período convalescente da doença para a produção dos anticorpos de captura e do conjugado. Uma alternativa à aplicação dos anticorpos de mamíferos no diagnóstico é o uso da imunoglobulina Y (IgY), encontrada no soro e gema dos ovos de aves e répteis. Essas proteínas têm varias vantagens quando comparadas com IgG alta resposta contra antígenos de mamíferos, redução da cor de fundo em ensaios imunoenzimáticos e de serem obtidas por um método não-invasivo (coleta da gema dos ovos). O objetivo deste trabalho foi a obtenção de anticorpos IgY anti-HAV produzidos em galinhas imunizadas contra o vírus da Hepatite A (HAV) e o desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anti-HAV total utilizando IgY anti-HAV como imunoglobulinas de captura e conjugado. Cinco grupos de galinhas foram imunizadas com diferentes inóculos contendo vacina com e sem o adjuvante CpG-ODN, HAV com adjuvante incompleto de Freund (IFA) com e sem o adjuvante CpG-ODN e um grupo controle com IFA. Os ovos foram coletados e a gema foi purificada pela precipitação com polietileno glicol. A solução purificada contendo IgY anti-HAV foi avaliada para determinação da concentração da IgY anti-HAV por espectrofotometria e sua especificidade e título foram determinados à partir de um teste imunoenzimático. Os anticorpos foram conjugados com a peroxidase e foi estabelecida a diluição ideal para os anticorpos de captura e conjugado.Para avaliar o ensaio imunoenzimático in-house com IgY anti-HAV, foi avaliado um painel composto de 100 amostras positivas e 100 amostras negativas para anti- HAV-total. A presença da IgY anti-HAV nas gemas dos ovos foi confirmada por SDS-PAGE e Western Blotting, e após a purificação, a média da concentração de proteínas nas gemas dos ovos foi de 8,7406 mg /mL. O grupo imunizado com HAV, IFA e CPG-ODN apresentou os maiores títulos de anticorpo. O ensaio in-house apresentou sensibilidade de 84por cento, especificidade de 79por cento e eficiência de 81,5por cento. Os métodos utilizados para a produção de IgY anti-HAV e sua conjugação com peroxidase foram eficientes e o ensaio imunoenzimático in-house IgY anti-HAV demonstrou uma boa sensibilidade e especificidade. A produção de anti-HAV IgY apresenta vantagens quando comparado com obtenção da IgG anti-HAV. O teste imunoenzimático in house com IgY anti- HAV pode ser uma alternativa a utilização da IgG nos ensaios imunoenzimáticos.