Aplicación de las pruebas de PCR convencional simple y múltiple para la identificación de aislamientos de Leptospira spp. en Colombia / Application of conventional and multiplex PCR assays for identification of isolates of Leptospira spp. in Colombia

RESUMEN

Debido a las dificultadas asociadas con la identificación serológica de aislamientos de Leptospira ssp, se genera gran interés en la pruebas moleculares por su poder discriminatorio, reproducibilidad y fácil interpretación. Objetivo. Aplicar y validar la prueba de PCR convencional, usando dos pares de iniciadores descritos previamente y dirigidos a los genes lipL32 (PCR simple) y secY/flaB (PCR múltiple), con el fin de evaluar su aplicación para identificar especies patógenas y saprófitas de Leptospira spp. Materiales y métodos. Para la estandarización de las pruebas de PCR se usó 22 cepas de referencia internacional y 12 aislamientos colombianos. Se determinó el nivel de detección de cada pareja de iniciadores, su especificidad frente a otros microorganismos causantes de enfermedades endémicas en Colombia y su capacidad de identificar especies dentro del grupo de Leptospira. Resultados. El límite de detección de la PCR simple lipL32 fue una dilución 110000 y para la PCR múltiple secY/flaB fue una dilución 1100 para el gen secY y 11000 para flaB. La especificidad de todos los iniciadores fue de 100 por ciento. La PCR simple lipL32, mostró amplificado específico para 21/22 cepas de referencia mientras que la PCR multiple secY/flaB lo fue para 18/22 cepas. De los 12 aislamientos colombianos, siete fueron positivos por PCR lipL32 y seis lo fueron por PCR secY/flaB. Conclusiones. Los resultados más consistentes fueron obtenidos con la PCR simple lipL32 tanto en límite de detección, especificidad y utilidad para la identificación de Leptospira spp, por lo que esta prueba es aplicable a la identificación molecular de aislamientos patógenos de Leptospira spp de diversas fuentes.

ABSTRACT

Serological identification of Leptospira ssp isolates is difficult to achieve. Thus, molecular testing may be of great interest thanks to its high discrimination power, reproducibility and easy interpretation. Objective. To implement and validate conventional and multiplex PCR methods (using primers directed against lipl32 and secY/flaB genes, respectively). To assess the capacity of PCR methods to identify pathogenic and saprophytic species of Leptospira ssp. Material and methods. 22 international reference strains and 12 colombian isolates were used. DNA was extracted with a commercial kit (Wizard). Specificity and sensitivity of both PCR methods were evaluated. Results. The maximum dilution of DNA samples allowing the detection of Leptospira ssp was determined to be 110000 for the PCR lipL32 and 1100/11000 for the multiplex PCR secY/flaB. Both PCR didn’t detect DNA from microorganisms unrelated to Leptospira ssp. The lipL32 PCR specifically amplified a 423bp fragment from all pathogenic Leptospira reference strains, while the secY/flaB PCR amplified both 285bp (secY) and 793bp (flaB) fragments from 18 reference strains. The lipL32 PCR detected 7/12 colombian isolates, while secY/flaB PCR detected both secY and flaB genes from 6/12 isolates. Conclusions. Best results were obtained with the lipL32 PCR, which displayed a better sensitivity and a better capacity to detect different strains than the multiplex PCR. The secY primers showed a poor specificity to pathogenic species and a poor sensitivity. Thus, lipL32 primers show high potential for molecular diagnosis of Leptospira spp in clinical and environmental samples.