Normalización de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del herpesvirus humano 8 / Standardization of a real-time polymerase chain reaction system for quantification of human herpesvirus 8

RESUMEN

OBJETIVO: normalizar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para determinar la carga viral del herpesvirus humano 8, en diferentes muestras clínicas de pacientes en los que se sospeche la infección por este agente. MÉTODOS: se evaluaron 3 de los métodos reportados internacionalmente para obtener ADN estándar en la construcción de curvas externas estándar, que permiten determinar el número de copias de ADN diana en la muestra problema. RESULTADOS: se obtuvieron 3 ADN estándar a partir del clonaje de un fragmento del gen ORF26 del herpesvirus humano 8 en un vector (ADN plasmídico), con la utilización de productos purificados de reacción en cadena de la polimerasa y el empleo de ADN genómico de la línea celular BCBL. Se pudieron construir las curvas patrón a partir de cada uno de los ADN estándar obtenidos, los que mostraron una fuerte correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de 6 magnitudes de concentración de ADN diana. El límite inferior de detección a partir del ADN plasmídico y de los productos de reacción en cadena de la polimerasa fue de hasta 100 copias, mientras que con el ADN genómico fue de hasta 10 copias; este último sistema resultó el más sensible. CONCLUSIONES: la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real normalizada a partir de los 3 ADN estándar probó ser un sistema rápido, específico y altamente sensible que permitirá un mejor diagnóstico y además desarrollar estudios sobre la patogenia de la infección por el herpesvirus humano 8 en Cuba.

ABSTRACT

OBJECTIVE: to standardize a real-time polymerase chain reaction system to determine the human herpes virus 8 viral load in several samples from patients suspected of this type of infection. METHODS: three internationally known methods were evaluated to obtain standard DNA in standard external curve constructions, which allow determining the number of target DNA copies in the suspected samples. RESULTS: three standards DNA were obtained from cloning ORF26 gene fragment of human herpesvirus 8 in a vector (plasmid DNA), with the use of purified polymerase chain reaction products and of genomic DNA of BCBL cell lines. The pattern curves were constructed on the basis of each of the resulting standard DNA, which showed strong linear correlation (r= -1) and very low error values throughout 6 target DNA concentrations. The lower detection limit based on plasmid DNA and the polymerase chain reaction products was 100 copies, whereas that obtained with genomic DNA reached up to 10 copies; this last system turned to be the most susceptible. CONCLUSIONS: real-time polymerase chain reaction system, standardized for the three standard DNA proved to be a rapid, specific and highly sensitive system for better diagnosis, and for the development of studies on the pathogenesis of human herpesvirus 8 infection in Cuba.