Geração de espécies reativas por exossomos plaquetários: um possível novo mecanismo de disfunção vascular na sepse / Generation of reactive oxygen species by platelet-derived exosomes: a possible novel mechanism of vascular dysfunction in sepsis

RESUMO

Sepse, a resposta do organismo a uma infecção, está associada a altas taxas de mortalidade. A razão pela qual um mecanismo protetor resulta num quadro clínico fatal permanece inexplicada. Em trabalho prévio nosso grupo demonstrou que exossomos de origem plaquetária são os mais frequentes em plasma de pacientes com choque séptico e que estes podem induzir apoptose em células musculares lisas vasculares e células endoteliais em cultura. Demonstramos ainda que tais exossomos possuíam uma fonte enzimática de ROS, uma NADPH oxidase cuja atividade poderia estar associada à indução da apoptose (Janiszewski et al., 2004). No presente trabalho, nós buscamos criar um modelo de geração ex vivo de exossomos similares aos encontrados em pacientes sépticos e identificar possíveis vias responsáveis pela liberação destes e seus efeitos. Choque séptico é uma condição relacionada com exposição a lipopolissacarídeo (LPS) e geração de alta quantidade de trombina, TNF e espécies reativas de nitrogênio. Através de citometria de fluxo revelamos que plaquetas humanas expostas ao doador de NO dietilamina-NONOato e ao LPS geraram exossomos similares àqueles encontrados em pacientes com choque séptico, expondo alta quantidade de tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 mas pouca fosfatidilserina. Por outro lado, plaquetas expostas à trombina ou TNF liberaram partículas com características claramente distintas, com alta exposição de fosfatidilserina e baixa de tetraspaninas. Assim como os exossomos sépticos, os exossomos obtidos pela exposição de NO e LPS geraram radical superóxido e NO, como demonstrado pela quimioluminescência da lucigenina (5M) e celenterazinina (5M) e pela fluorescência da 4,5-diaminofluoresceína (10mM) e 2,7-diclorofluoresceína (10mM). A análise por Western Blot nos permitiu identificar as subunidades Nox1, Nox2 e p22phox da NADPH oxidase e a isoforma induzível da enzima NO sintase (NOS) nesses exossomos. Como esperado, inibidores da NOS e da NADPH oxidase...

ABSTRACT

Sepsis, the bodys response to infection, is associated with high mortality rates. Why a protective mechanism turns into a deadly clinical picture is a matter of debate, and goes largely unexplained. In previous work we demonstrated that plateled derived exosomes are found in the plasma of septic patients with septic shock and can induce endothelial and vascular smooth muscle cell apoptosis in culture through an enzymatic superoxide source (Janiszewski et al., 2004). In this work we sought to create a model for ex vivo generation of exosomes, and to identify the pathways responsible for ROS release by exosomes and their effects. Septic shock is a condition related to exposure of lipopolysaccharide (LPS), generation of high amounts of thrombin, TNF and nitrogen reactive species. Through flow cytometry we demonstrated that human platelets exposed to the NO-donor diethylamine-NONOate, and to LPS, generated exosomes similar to those found in the blood of septic shock patients, with high exposure of the tetraspanin CD9, CD63, and CD81, but little phosphatidylserine. On the other hand, platelets exposed to thrombin or TNF released particles with clearly distinct characteristics, such as high phosphatidylserine and low tetraspanin. Like the septic exosomes, the exosomes obtained by NO and LPS exposure generated superoxide radical and NO, as disclosed by lucigenin and coelenterazine chemiluminescence and by 4,5-diaminofluorescein and 2,7-dichlorofluorescein fluorescence. Western Blot analysis revealed the presence of Nox1, Nox2 and p22phox NADPH oxidase subunits and the inducible isoform of NO synthase (NOS) in these exosomes. As expected, NOS inhibitors or NADPH oxidase inhibitors significantly reduced the fluorescence and chemiluminescente signals. In addition, endothelial cells exposed to NO or LPS generated exosomes underwent apoptotic death, while control exosomes had no effects on apoptosis. NADPH oxidase as well as NOS inhibition significantly reduced...