Purificación y determinación de carbohidratos en la vicilina de Canavalia ensiformis / Purification and carbohydrate determination of vicilin from Canavalia ensiformis

RESUMEN

Este estudio reporta la purificación y determinación de carbohidratos en la vicilina de Canavalia ensiformis ( Jack bean). La vicilina se purificó por precipitación isoeléctrica a pH 6,4 y 4,8, cromatografía de intercambio iónico (DEAE -Sephadex A-50) y cromatografía de afinidad (Con A -Sepharosa 4B). La pureza de la proteína se verificó por SDS-PAGE y su identidad se confirmó por espectrometría de masas empleando la técnica de ionización MALDI (desorción-ionización con láser asistida por una matriz) en un espectrómetro de tiempo de vuelo (TOF) obteniéndose un espectro de masas característico de la proteína (PMF) (MALDI-TOF-PMF).La oxidación de residuos glicosídicos en la vicilina demostró la presencia de carbohidratos en la proteína, lo cual se corroboró por deglicosilación enzimática con Péptido N-glicosidasa F (PNGasa F) y por el método de Dubois, el cual mostró un contenido de carbohidratos del 4,03% en la proteína. Estos resultados muestran, por primera vez, la presencia de glicósidos en la vicilina de Canavalia ensiformis.El proceso de purificación de la vicilina de la semilla de Canavalia ensiformis, desarrollado en este trabajo, permitió obtener la proteína con un grado de pureza muy superior al descrito previamente en la literatura.

ABSTRACT

This study reports the purification and carbohydrate determination of vicilin from anavalia ensiformis (Jack bean). The vicilin was purified by isoelectric precipitation at pH 6.4 and 4.8, ion exchange chromatography (deae-Sephadex A-50) and affinity chromatography (Con A -Sepharosa 4B). Protein identity was confirmed by mass spectrometry (maldi-tof-pmf) (Matrix assisted laser desorption ionizationtime of flight-Peptide mass fingerprinting) and purification was confirmed by sdspage. Oxidation of glycosylated moiety in pure vicilin demonstrates the presence of carbohydrates in the protein. The presence of carbohydrates in the pure vicilin fraction was confirmed by enzymatic deglycosylation by Peptide N-glycosidase F (PNGasa F) and by Dubois’ method, finding a 4.03% carbohydrate content in such protein. These results demonstrate for the first time the presence of glycosides in C. ensiformis vicilin. The purification process of vicilin seed of Canavalia Ensiformis used in this study allowed us to obtain a protein with a high degree of purity, superior to the ones described in the literature.