A PCR assay for the identification of Leishmania species of the Viannia subgenus / Un ensayo de PCR para identificar especies de Leishmania del subgénero Viannia

ABSTRACT

We have identified a novel DNA sequence of 500 bp (β500-DNA) on the Leishmania (Viannia) subgenus, located in the intergenic region of one of the loci of the β-tubulin gene family. The sequence analysis showed that this sequence has no homology to any other sequence described so far, including the β-tubulin gene. We improved a specific β500-PCR assay, which generated a PCR product of 375 bp for total genomic DNA from Leishmania strains belonging to the L. (Viannia) subgenus. In contrast, no amplification was found when using genomic DNA from species of L. (Leishmania) subgenus or other organisms. Under our PCR conditions, the lower detection limit was 1 fg when a purified DNA clone (pLgβ4), which contains one copy of the β500-DNA sequence, was used. The β500-DNA PCR assay confirmed the preliminary diagnosis of cutaneous leishmaniasis in clinical samples in which the Montenegro skin test was positive and parasite cultures were negative. The analytical specificity and the sensitivity of the PCR assay provide a tool for epidemiological studies of the disease.

RESUMEN

En este trabajo identificamos una nueva secuencia de DNA de 500 pb (β500-DNA) en Leishmania del subgénero Leishmania (Viannia), localizada en la región intergénica de uno de los loci de la familia de los genes de la β tubulina. El análisis de secuencia mostró que β500 no tiene homología con ninguna otra secuencia previamente descrita, incluido el gen de la β tubulina. Nosotros implementamos un ensayo de PCR específico para β500, β500-PCR, que genera un producto de PCR de 375 pb a partir del DNA genómico de cepas de Leishmania pertenecientes al subgénero L. (Viannia). No hubo amplificación alguna cuando se utilizó el DNA genómico de especies del subgénero L. (Leishmania) o el de otros organismos. En las condiciones establecidas, utilizando DNA purificado del clon pLgβ4, que contiene una copia de la secuencia de DNA de β500, el límite de detección más bajo fue de 1 fentogramo. El ensayo β500-PCR confirmó el diagnóstico preliminar de leishmaniasis cutánea en muestras clínicas de pacientes positivas a la prueba de Montenegro y negativas en el cultivo de parásitos. La especificidad y sensibilidad analítica del ensayo de PCR proporciona una herramienta para estudios epidemiológicos de la enfermedad.