Desenvolvimento e validação de insumos para diagnóstico de infecções pelo vírus da dengue / Production and validation of diagnostic inputs for dengue virus infections

RESUMO

A dengue é uma doença causada por um flavivírus, representado por quatro sorotipos distintos (DENV1-4). Entre as proteínas virais, ENV e NS1 contribuem fortemente com o processo de resposta imune desencadeado pelo vírus. Os principais sistemas de diagnóstico utilizam a detecção de anticorpos através da técnica Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA, a qual, embora útil, apresenta inúmeras limitações (custo, tempo de processamento, entre outros). Neste trabalho, nós desenvolvemos ensaios multiplex de microarranjos líquidos para ENV e NS1. Sequências de aminoácidos codificantes das proteínas, provenientes de cepas isoladas da América Latina foram selecionadas em bancos de dados públicos, alinhadas para a geração das respectivas sequências consenso e construção dos antígenos recombinantes. As sequências obtidas foram otimizadas para expressão bacteriana, submetidas à síntese comercial e clonadas em vetores de expressão procarióticos. Os antígenos foram expressos e validados através de ensaios de microarranjos líquidos, com obtenção de promissores resultados, especialmente para as proteínas ENV (domínios I/II) sorotipo 1 e 2, com potencial aplicação comercial. Este trabalho desenvolveu ainda metodologia para renaturação de NS1 com excelente rendimento. Os resultados das proteínas produzidas neste trabalho foram de forma geral superiores aos obtidos por antígenos comercialmente disponíveis para a proteína ENV de dengue vírus, utilizando a mesma metodologia. As proteínas NS1 foram ainda utilizadas para imunização de coelhos e produção de anticorpos policlonais, que se mostraram bem sucedidos para aplicações em ensaios de imunofluorescência, western blot, citometria de fluxo e como anticorpo de detecção para ensaios quantitativos para a proteína NS1 por ELISA de captura. Os resultados obtidos neste projeto foram considerados extremamente promissores, com potencial aproveitamento no desenvolvimento de testes diagnósticos comerciais com alta precisão, rápidos e com baixo custo.