Desenvolvimento e padronização de novas metodologias aplicadas ao diagnóstico e monitoração de cura da esquistossomose mansoni na fase inicial (aguda) e crônica / Development and standardization of new methods applied to the diagnosis and monitoring of cure of schistosomiasis in the initial phase (acute) and chronic

RESUMO

Neste projeto, foram testados diferentes antígenos candidatos a padronização de novos métodos diagnósticos a serem usados nas diferentes fases da infecção esquistossomótica. Inicialmente, foram analisados os antígenos brutos do parasito visto que seu baixo custo e simplicidade de obtenção merecem novas abordagens. Assim, antígenos de vermes adultos, ovos e tegumento de esquistossômulos foram analisados com soro de pacientes submetidos a rigoroso diagnóstico parasitológico para determinação de infecção e/ou diagnóstico clínico e imunológico. Ao serem aplicados no método indireto de ELISA, estes antígenos apresentaram alta sensibilidade e especificidade em fases distintas da infecção murina. Através desses resultados foi possível confirmar que o uso de antígenos obtidos de diferentes formas evolutivas do parasito serve como ferramenta potencial para análise da evolução cronológica da infecção. Quando aplicados em amostras humanas, o uso de antígenos de vermes adultos mostrou-se promissor para o diagnóstico de pacientes residentes de áreas endêmicas que apresentavam baixa carga parasitária, com índices de sensibilidade e especificidade de 95%. Tendo sido, nestas condições, superior aos antígenos de ovos. O estudo de pacientes em fase aguda da infecção permitiu a validação da técnica indireta de ELISA com antígenos de tegumento de esquistossômulos. Esta técnica apresentou uma significativa sensibilidade na identificação de grande parte dos pacientes recentemente infectados. A outra abordagem adotada por este tarbalho envolveu o uso do Antígeno Catódico Circulante (CCA), antígeno este secretado/excretado por vermes jovens e adultos, que foram direcionados para o desenvolvimento de novas e promissoras metodologias diagnósticas. Para este propósito, o CCA foi utilizado em diferentes formas antigênicas: como glicoproteína purificada a partir de vermes, como proteína recombinante e como peptídeos imunogênicos de 20 aminoácidos. Estes antígenos foram usados na padronização do Método de Separação Imunomagnética, denominado IMS. O uso de CCA recombinante no método de IMS indireto levou aos índices mais significativos de sensibilidade e especificidade, sem que qualquer resultado falso-negativo fosse detectado. Por outro lado, o uso da glicoproteína CCA purificada demonstrou ser superior no diagnóstico para monitorização de cura. A partir destes resultados, mais promissores que a ELISA convencional, partimos para a padronização final desta técnica para a detecção direta do CCA nas mesmas amostras, de forma a permitir somente a identificação de infecções ativas. Para isto, anticorpos monoclonais específicos para a glicoproteína CCA foram produzidos e conjugados a marcadores. A escolha do clone foi baseada na reduzida especificidade deste pela porção responsável pelas reações cruzadas do CCA, a porção glicídica Lewis x. O novo método IMS para detecção direta demonstrou alta sensibilidade de 94% e especificidade de 100%, apresentando correlação direta com a carga parasitária destes pacientes determinada pela contagem de ovos nas fezes. Os excelentes resultados na detecção de antígeno circulante obtidos no presente trabalho, que contrapõem os obtidos em outros trabalhos publicados, se devem a nova metodologia empregada que utiliza a concentração destes antígenos ao invés da diluição de amostras. Por fim, idealizamos um último método, denominado FluoIMS, destinado a identificação qualitativa da presença de CCA através da microscopia de fluorescência. Este método, de detecção direta e de execução bastante simples, apresentou significativos índices de sensibilidade quando três lâminas individuais para cada amostra foram analisadas. Nossos resultados trazem grandes expectativas para a melhoria do diagnóstico dos muitos pacientes infectados por baixas cargas do Schistosoma mansoni, em diferentes fases da infecção, e apontam novas perspectivas para aplicação destes métodos no controle de cura pós-tratamento.