Determinação de 25-hidroxivitamina D2 e D3 em plasma por CLAE-DAD / Determination of 25-hidroxy-vitamin D2 and D3 in plasma by HPLC-DAD

RESUMO

INTRODUÇÃO: O interesse pela vitamina D nos últimos anos teve aumento significativo. Estudos epidemiológicos realizados têm demonstrado um crescente aumento da deficiência de vitamina D entre a população. O marcador diagnóstico de escolha para determinar os níveis de vitamina D é a concentração de 25-hidroxivitamina D (25(OH)D), com suas frações D2 (25(OH)D2) e D3 (25(OH)D3). OBJETIVO: Desenvolver uma metodologia analítica empregando cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) para a determinação de 25(OH)D3 e 25(OH)D2 em plasma. MATERIAIS E MÉTODOS: 25(OH)D3 e 25(OH)D2 foram extraídos das amostras de plasma com hexano, utilizando-se dodecafenona como padrão interno (PI). Utilizou-se coluna analítica ACE 5 C18 com partículas de 5 µm e dimensões de 150 × 4,6 mm, fase móvel metanol-água (8020; v/v) e quantificação em 265 nm. RESULTADOS: A exatidão foi entre 98,4 e 107,5%. A precisão intraensaios esteve entre 6,5% e 9,2% para 25(OH)D3 e entre 3,7% e 8,7% para 25(OH)D2. A precisão interensaios esteve entre 2,9% e 6% para 25(OH)D3 e entre 4% e 4,5% para 25(OH)D2. O limite inferior de quantificação foi 10 ng/ml. As concentrações encontradas em amostras de 32 pacientes idosos estiveram entre 10,1 e 32,4 ng/ml, caracterizando deficiência de vitamina D nesse grupo. DISCUSSÃO O método foi capaz de quantificar 25(OH)D2 e 25(OH)D3 com uma preparação de amostra relativamente simples e rápida. O método foi seletivo, com separação adequada dos metabólitos e do padrão interno e sem presença de interferentes. CONCLUSÃO: O método desenvolvido apresenta desempenho analítico adequado e pode ser aplicado em condições clínicas.

ABSTRACT

INTRODUCTION: The interest in vitamin D has increased significantly in recent years. Epidemiological studies conducted over the past 25 years have shown a steady increase in vitamin D deficiency. The diagnostic marker of choice to determine vitamin D levels is the concentration of 25-hidroxy-vitamin D (25(OH)D) in the fractions D2 (25(OH)D2) and D3 (25(OH)D3). OBJECTIVE: To develop an analytical method using high-performance liquid chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD) for the determination of 25(OH)D2 and 25(OH)D3 in plasma. MATERIALS AND METHODS: 25(OH)D3 and 25(OH)D2 were extracted from plasma samples with hexane and dodecaphenone was used as internal standard. The separation was performed in an ACE 5 C18 column, with particle size of 5 µm (4,6 × 150 mm), mobile phase methanol-water (8020, v/v) and quantification at 265 nm. RESULTS: Accuracy was in the range of 98.4 to 107.5%. Intra-assay precision was between 6.5 and 9.2% for 25(OH)D3 and 3.7 and 8.7 for 25(OH)D2. Inter-assay precision was between 2.9 and 6% for 25(OH)D3 and 4 and 4.5 for 25(OH)D2. The limit of quantification was 10 ng/l. Concentrations of 25(OH)D3 in samples from 32 elderly patients were between 10.1 and 32.4 ng/ml, characterizing vitamin D deficiency in this group. DISCUSSION: The method allowed the quantification of 25(OH)D2 and 25(OH)D3. Furthermore, the sample preparation was relatively simple and fast. The method was selective with an adequate separation of metabolites and internal standard with no interfering substances. CONCLUSION: Not only did the developed method show suitable analytical performance, but it may also be applied in clinical conditions.