Desenvolvimento e validação de um método por CLAE-EM/EM para determinação de PGE2 e PGD2 em meio de cultivo celular e avaliação da recuperação das prostaglandinas utilizando diferentes condições na extração em fase sólida / Development and validation of HPLC-MS/MS method to determine PGE2 and PGD2 in cell culture medium and assessment of recovery of the prostaglandins by solid phase extraction under various conditions

RESUMO

Tradicionalmente, estas prostaglandinas são quantificadas por técnicas de imuno-ensaio, que apresentam diversas desvantagens. Estes metabólitos são isômeros estruturais, e dessa forma é necessário o uso de técnicas de detecção seletivas, como cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (CLAE-EM/EM). Para a extração de prostaglandinas de matrizes complexas, destaca-se a extração em fase sólida (EFS), que otimizada, fornece excelentes taxas de recuperação. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método rápido por CLAE-EM/EM, para análise simultânea de PGE2 e PGD2 de meio de cultivo celular e avaliar a eficiência de extração em diferentes condições de EFS, em relação ao método proposto pelo fabricante dos cartuchos. A separação ocorreu com coluna de fase reversa (C18, 150mm x 2.1mm, 5μm) eluída no modo gradiente com acetonitrila e água (0,1% AFO). Dez condições diferentes de EFS foram testadas. O método desenvolvido foi adequado para a análise simultânea de PGE2 e PGD2 , apresentando resolução de ~1,5 entre os picos e corrida de 11 minutos. LD da ordem de 0,5 ng/mL e LQ de 1,0 ng/mL foram obtidos para ambos os analitos. A linearidade de PGE2 e PGD2 apresentou r>0,99. Variações inferiores a 6,51% e 5,93% foram encontradas para repetibilidade e precisão intermediária, respectivamente. Foi possível diminuir perdas durante a EFS e aumentar a recuperação dos analitos. A condição que ofereceu melhor eficiência de extração aumentou o rendimento em 181% para PGE2 e 323% para PGD2 , em relação ao método proposto pelo fabricante.

ABSTRACT

PGE2 and PGD2 are very important pro-inflammatory mediators. Traditionally, these prostaglandins are estimated by immunoassay techniques, which have several disadvantages. Since these metabolites are structural isomers, it is necessary to use selective detection techniques, such as liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). For the extraction of prostaglandins from complex matrices, solid phase extraction (SPE) is an outstanding method that can be optimized to provide excellent recovery. The aim of this study was to develop and validate a rapid method for the simultaneous analysis of PGE2 and PGD2 in cell culture medium by HPLC-MS/MS and to assess the extraction efficiency of SPE under various conditions, compared to the generic method proposed by the manufacturer of the cartridges. The analytes were separated on a reversed-phase column (C18, 150mm x 2.1mm, 5μm), eluted in a gradient of acetonitrile and water (0.1% formic acid). Ten different conditions for SPE were tested. The method was suitable for the simultaneous analysis of PGE2 and PGD2 , showing a resolution of ~1.5 between the peaks and a run time of 11 minutes. LOD of 0.5 ng/mL and LOQ of 1.0 ng/mL were recorded for both analytes. The linearity of the analytical curves for both PGE2 and PGD2 showed r>0.99. Variations of less than 6.51% and 5.93% were found for repeatability and intermediate precision, respectively. It was possible to reduce the losses during SPE and enhance the recovery of the analytes. The condition affording the best extraction efficiency increased the yield by 181% for PGE2 and 323% for PGD2 , relative to the method proposed by the manufacturer.