Estudo da influência das soluções desmineralizadoras na atividade proteolítica da dentina humana sadia / The influence of demineralizing solutions in the proteolytic activity of human dentin healthy

RESUMO

A degradação da interface adesiva em dentina pode acometer tanto a porção resinosa como a porção orgânica da camada híbrida. Evidências indicam que a degradação da porção orgânica pode ocorrer em parte devido a atividade enzimática de proteases da própria dentina. As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem a primeira classe de enzimas relacionada com a degradação da matriz orgânica. É possível que as MMPs, possam ser reativadas durante o procedimento adesivo em conseqüência da queda do pH do meio. Objetivo: Esta investigação teve como objetivos avaliar a influência de soluções desmineralizadoras com diferentes concentrações de ácido fosfórico (AF1%, AF10% e AF37%) na atividade proteolítica da dentina humana sadia, na degradação do colágeno exposto pela desmineralização, além de identificar imunologicamente as metaloproteinases. Material e Métodos: Vinte dentes molares permanentes foram triturados para obtenção de um pó de dentina. Alíquotas de 1g do pó foram acondicionadas em tubos plásticos para que a desmineralização do substrato pudesse ser realizada de acordo com as três diferentes concentrações de ácido fosfórico testadas. Após a neutralização do ácido com NaOH, as amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para mensuração espectrofotométrica do conteúdo de Cálcio (Ca) liberado pela desmineralização. O precipitado obtido foi incubado com tampão de extração de proteínas por 24h a 4°C sob agitação. Nova centrifugação foi realizada e o sobrenadante utilizado para avaliação da atividade da MMP-2 e MMP-9 por zimografia e para a identificação imunológica das metaloproteinases por western blot. O precipitado obtido pela centrifugação foi liofilizado e separado em alíquotas de 40mg (n=10) de pó de dentina para cada condição experimental. As alíquotas foram incubadas em saliva artificial por 24h a 37°C sob agitação e hidrolisadas em autoclave. Após incubação a 65°C por 40 min, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria para que a mensuração da concentração do aminoácido hidroxiprolina (HYP) liberado pela degradação do colágeno exposto pudesse ser obtida. Fatias de 0.3 mm da dentina coronária de outro dente foram obtidas e desmineralizadas, de acordo com as diferentes concentrações de ácido fosfórico para avaliação da atividade enzimática através do método da zimografia in situ. Os resultados foram submetidos à análise de variância de um fator sem vinculação ou teste de Kruskal-Wallis para identificação das diferenças existentes entre os grupos experimentais. Para contraste das médias foi realizado o teste de Student-Newman-Keuls com nível de significância de 5% (=0,05). Resultados: A atividade enzimática de MMP-2 foi estatisticamente maior quando a dentina foi desmineralizada com AF 1% ou 10%. O uso do ácido fosfórico 37% diminuiu consideravelmente a atividade desta enzima, em relação ao AF10% (<0,05). Em nenhuma das amostras desmineralizadas com AF foi detectada a atividade enzimática da MMP-9. A identidade da MMP-2 foi confirmada pelo immunoblotting da enzima com anticorpo específico. A MMP-9 não foi expressa nos extratos analisados. A expressão de MMP-2 foi maior quando utilizado AF 1% ou 10% e menor quando foi utilizado o AF 37%.

ABSTRACT

The dentin adhesive interface degradation can occur in resin and in organic portion of the hybrid layer. Evidence indicates that the degradation of organic matrix may partially occur due to the enzymatic activity of proteases own dentin. The matrix metalloproteinases (MMPs) have been described as the first class of enzymes associated with degradation of the organic matrix. It is possible that MMPs may be reactivated during the adhesive procedure as a result of the fall of pH. Purpose: The objectives of the present investigation are to evaluate the influence of different demineralizing phosphoric acid solutions (PA1%, PA10% and PA37%) on the proteolytic activity of human sound dentin, on the collagen degradation that was exposed after demineralization, as well as to identify the metaloproteases immunologically. Material and Methods: Dentin powder was obtained from twenty human molars. One gram aliquots were placed in polyestyrene tubes and the dentin demineralization was performed using the three different phosphoric acid concentrations tested in this study. After neutralization with NaOH, the samples were centrifuged. The supernatant was used for the spectrophotometrically quantification of calcium (Ca) released by the demineralization while the precipitate was re-suspended and incubated with a protein extraction buffer for 24h at 4ºC under agitation. The sample was centrifuged and the supernatant was used for the identification of MMP-2 and MMP-9 by western blot and for the evaluation of gelatinolytic activity by zymography. The pellet was lyophilized and 40 mg aliquots of the dentin powder (n=10) were incubated in artificial saliva for 24h at 37°C under agitation and hydrolysed in autoclave after incubation at 65°C for 40 min. The samples were analyzed spectrophotometrically to measure the hydroxyproline (HYP) released after collagen degradation.