Comparación de métodos de extracción de RNA para la detección por RT-PCR del Potato yellow vein virus (PYVV) en diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja / Comparison of RNA isolation methods for Potato yellow vein virus (PYVV) detection by RT-PCR in different organs of Solanum tuberosum Group Phureja

RESUMEN

Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contiene genoma tripartita de ssRNA(+), se limita al floema y causa pérdidas en la producción. Es un virus re-emergente y cuarentenario en Europa y Estados Unidos. La detección se ha basado en RT-PCR, NASH y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) en muestras de foliolo y tubérculo. Se desconoce como es la distribución del virus en plantas infectadas lo que hace necesario establecer un método de extracción de RNA, que sea eficiente en la obtención de material a partir de diferentes órganos. El objetivo de este trabajo fue comparar tres métodos de extracción de RNA uno basado en Tioisocianato de guanidina (Trizol® (Invitrogen)), uno que utiliza bromuro de hexadecil trimetil amonio (CTAB) y el método fenol/cloroformo seguido por purificación con columnas de Sephadex; para detectar el virus por RT-PCR en foliolo, peciolo, pedúnculo floral, pétalos, tallo aéreo y subterráneo, antera y brotes de tubérculo; de plantas infectadas. Los métodos de extracción fueron evaluados en términos de la integridad (relación de la intensidad de las bandas de las subunidades ribosomales 28S/18S), calidad (relación de las lecturas espectrofométricas 260/280nm) y rendimiento de los extractos. PYVV se detectó por RT-PCR en todos los órganos analizados por los tres métodos de extracción. No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres métodos de extracción; sin embargo, Trizol® (Invitrogen) presentó mayor rendimiento, calidad e integridad; además, permitió la detección del virus por RT-PCR en todos los órganos evaluados.

ABSTRACT

Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contains a tripartite genome with ssRNA(+), is phloem limited and can affect yield reduction. PYVV is a re-emergent virus and is a quarantine pathogen in Europe and United States. The detection has been based in RT-PCR, NASH and real time RT-PCR (RT-qPCR) in leaflets and tuber shoots samples. It is not known how is the distribution of PYVV within infected plants, for that is necessary to establish an efficient RNA isolation method for obtaining material from different organs. The objective of the present work was to evaluate three RNA isolation methods: a Trizol® (Invitrogen) based method, a method using hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) and the phenol - chloroform method followed by Sephadex columns purification; for virus detection using RT-PCR in leaflets, petiole, peduncle, petals, stem, aerial and subterranean roots, anther and shoot tuber; of infected plants. The isolation methods were tested in terms of integrity (ratio of band intensity of 28S and 18S ribosomal subunits), quality (absorbance 260/280 ratio) and total yield. PYVV was detected by RT-PCR in all organs analyzed by the three isolation methods. There were no significant differences found among the three isolation methods, although, Trizol® (Invitrogen) presented high yield, quality and integrity, furthermore Trizol® (Invitrogen) allowed the virus detection using RT-PCR in all analyzed organs.