Caracterização bioquímica e celular da glutaminase isoforma Kidney-type com seus parceiros de interação / Biochemical and cellular characterization of Kidney-type glutaminase with their interaction partners

RESUMO

Células tumorais apresentam uma autonomia metabólica aumentada em comparação a células não-transformadas, incorporando nutrientes e metabolizando-os através de vias que suportam o seu crescimento e proliferação. O foco deste trabalho foi a enzima glutaminase, a qual processa glutamina em glutamato para posterior produção de alfa-cetoglutarato pela enzima glutamato desidrogenase, reabastecendo o ciclo do TCA e suportando seu funcionamento e geração de metabólitos essenciais para a síntese de macromoléculas. O gene GLS1 codifica para as isoformas glutaminase kidney-type (KGA) e glutaminase C (GAC). Estas proteínas apresentam outros domínios além do catalítico, e, no caso da KGA, repetições do tipo ankirin, sabidamente envolvidas em contatos proteínas-proteínas. Os objetivos deste projeto foram de encontrar parceiros de interação para a glutaminase kidney-type (KGA) e avaliar o impacto desta interação para o metabolismo tumoral. Um candidato inicialmente avaliado, a Aldolase A, não foi confirmado como parceiro de interação. Outro candidato, a BNIP-H, apesar de ter sido mostrado interagir com a KGA em células nervosas, não mostrou indícios de interação com a KGA em linhagem de células de câncer de mama. Por fim, estudos de duplo-híbrido em levedura revelaram o receptor nuclear PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) como forte candidato a parceiro de interação. Realizou-se um mapeamento dos domínios responsáveis pela interação entre estas duas proteínas, também por duplo híbrido, tendo sido identificado o domínio LBD da proteína PPARγ como envolvido na interação. Mesmo estudos realizados com fragmento da KGA, apesar de incompletos, mostraram que a interação não ocorre pelo domínio carboxi-terminal da enzima. Ensaios de anisotropia de fluorescência com as proteínas KGA e PPARγ purificadas indicaram que a interação é favorecida pela presença do produto da reação glutaminolítica, glutamato, e apresenta um Kd de 4,6 ± 0,5 μM...

ABSTRACT

Tumor cells have an increased metabolic autonomy compared to non-transformed cells, metabolizing nutrients and incorporating them through pathways that support cell growth and proliferation. The focus of this study was the glutaminase enzyme, which processes glutamine to glutamate for subsequent production of alpha-ketoglutarate, by the glutamate dehydrogenase enzyme, replenishing TCA cycle and bearing its function and the generation of metabolites essential for the synthesis of macromolecules. The gene GLS1 codes for the isoforms kidney-type glutaminase (KGA) and glutaminase C (GAC). These proteins exhibit other domains besides the catalytic, and in the case of KGA, ankirin repeats, known to be involved in protein-protein contacts. The goal of this project was to investigate potential interacting partners of KGA and contextualize the interaction within the metabolic demands of tumor cells. A candidate initially evaluated, the Aldolase A, was not confirmed as a partner of interaction. Another candidate, the BNIP-H, despite having been shown to interact with the KGA in nervous cells, showed no evidence of interaction with KGA in one tested breast cancer cell lines. Finally, yeast two-hybrid studies revealed the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) as a strong interaction partner candidate. We mapped the domains responsible for the interaction between these two proteins, also by two-hybrid and identified the LBD domain of PPARγ as involved in the interaction. The same studies with KGA fragments, although incomplete, showed that the interaction did not involve the carboxy-terminal domain of the enzyme. KGA and PPARγ proteins were expressed in E. coli, purified and their interaction was analyzed by pull-down, fluorescence anisotropy, electrophoresis under native conditions, gel filtration chromatography and crosslinking...