Triagem dos antígenos recombinantes de leishmania infantum utilizando a técnica demulti-antígenos impressos(mapia) no desenvolvimento de imunodiagnóstico paraleishmaniose visceral canina / Screening of recombinant antigens Leishmaniainfantum using the technique of multi-antigen print (mapia) in developing immunodiagnostic for canine visceral leishmaniasis

RESUMO

As leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes protozoários do. gênero Leishmania. Estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em. áreas de risco, com uma incidência anual de aproximadamente dois milhões de. novos casos no mundo. O cão é o principal reservatório dos centros urbanos e o flebótomo é o vetor responsável por sua transmissão. No Brasil, de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde, cães soropositivos para leishmaniose devem ser sacrificado. O diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde é feito com o teste rápido DPP-LVC® para triagem e o ELISA para confirmação. Trabalhos demonstram que o DPP-LVC® não é capaz de detectar uma parcela da população de cães, o que pode contribuir para a perpetuação da doença nestas áreas. Doze proteínas recombinantes (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) foram clonadas e sequenciadas em um estudo anterior, porém não foram completamente caracterizadas quanto à antigenicidade. Nossa hipótese é que um conjunto de antígenos selecionados a partir dessas proteínas recombinantes de L. infantum poderá ampliar a identificação de animais infectados em áreas endêmicas. O objetivo deste estudo foi identificar um conjunto de antígenos recombinantes de L. infantum, a partir de 12 antígenos previamente selecionados, quanto ao reconhecimento por soros de cães infectados para futuramente compor um teste imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina. No presente estudo, os 12 antígenos recombinantes previamente selecionados foram produzidos em nosso laboratório e purificados em Bio-Manguinhos. O ensaio de MAPIA (Multi-Antigen Print ImmunoAssay), que consiste em uma plataforma de triagem de antígenos em papel de nitrocelulose, mais próxima do teste rápido DPP-LVC®, foi utilizado para avaliação do reconhecimento dos 12 antígenos recombinantes por soros de cães infectados. Na triagem foram utilizados soros caninos positivos para leishmaniose visceral (n = 39), obtidos em estudo epidemiológico de corte transversal em área endêmica. Para avaliação da reatividade cruzada foram utilizados soros de cães com outras patologias leishmaniose tegumentar (n = 10), tripanossomíase canina (n = 10), babesiose (n = 10) e erliquiose (n = 11), além de soros de animais negativos (n = 40). Inicialmente, foi definido o melhor protocolo para ser utilizado nos ensaios de MAPIA. Posteriormente, a triagem dos antígenos foi realizada com os soros e, para avaliar, a confiabilidade dos resultados obtidos, os testes foram lidos por dois observadores de maneira independente. A concordância entre as leituras visuais dos dois observadores foi avaliada utilizando o índice Kappa. O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar diferenças estatísticas entre o índice de positividade das proteínas avaliadas. As proteínas Lci1A e Lci2B foram reconhecidas por 74% e 69%, respectivamente. As Lci4, Lci5 e Lci12 obtiveram reconhecimento de 33%, 31% e 33%, respectivamente pelos anticorpos presentes nos soros. Baixa reatividade dos soros de cães com babesiose, erliquiose, tripanossomíase canina foi observada com as 12 proteínas recombinantes avaliadas. Soros de cães com leishmaniose tegumentar foram os que apresentaram mais reatividade com as proteínas recombinantes. Analises combinatórias foram realizadas para identificar a partir dos 12 antígenos previamente selecionados, o conjunto destes capaz de identificar o maior número de soros de cães com leishmaniose visceral canina testados...

ABSTRACT

Leishmaniasis is an antropozoonosis caused by different protozoa of the genus Leishmania. It is estimated that approximately 350 million of people are at risk areas, with annual incidence of approximately two million new cases worldwide. The dog is the main reservoir in urban centers and the sandfly is the vector responsible for transmission. In Brazil, according to the recommendations of the Ministry of Health, seropositive dogs for leishmaniasis should be euthanized. The diagnosis is made by the DPP-LVC® as screening and ELISA as confirmatory. Studies have shown that DPP-LVC® is not able to detect a portion of the dog population, which may contribute to the perpetuation of the disease in these areas. Twelve recombinant proteins (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13) were cloned and sequenced in a previous study, but were not fully characterized for antigenicity. Our hypothesis is that a set of selected recombinant antigens of L. infantum may increase the identification of infected animals in endemic areas. The aim of this study was identify a set of recombinant antigens of L. infantum from 12 previously selected for recognition by sera from infected dogs to compose an immunodiagnostic test for canine visceral leishmaniasis. The 12 recombinant antigens were produced in our laboratory and purified in Bio-Manguinhos. MAPIA (Multi-Antigen Print ImmunoAssay), which consists in a screening platform for antigen in nitrocellulose paper, was used to assess the recognition of recombinant antigens for 12 sera of dogs infected. MAPIA is closer to rapid test DPP-CVL® than other screening tests. We used this screening method with sera positive for canine visceral leishmaniasis (n = 39) obtained in a cross-sectional epidemiological study in endemic area. For evaluation of cross-reactivity, sera from dogs with other diseases cutaneous leishmaniasis (n = 10), canine trypanosomiasis (n = 10) babesiosis (n = 10) and ehrlichiosis (n = 11), and animal sera negative (n = 40) were used. Initially, was decided that the best protocol to be used in the assays. Subsequently, screening of antigens was performed with sera and to evaluate the reliability of the results, the tests were read by two observers independently. The agreement between visual readings of the two observers was assessed using the kappa index...