Padronização da análise de mutações no gene TP53 em carcinomas de células escamosas de boca em material parafinado / Standardization of TP53 gene mutations analysis on oral squamous cell carcinoma from paraffin-embedded tissues

ABSTRACT

Introduction: The tumor protein p53 gene (TP53) is a constant target of investigation in cancer pathogenesis. Analysis by immunohistochemistry provides limited data about p53 in oral carcinogenesis, and TP53 sequencing can contribute to this analysis. However, obtaining high-quality and contamination-free deoxyribonucleic acid (DNA) for a proper amplification can be a difficult task when using paraffin-embedded tissues. Objective: Standardize DNA extraction, polymerase chain reaction (PCR) amplification and DNA sequencing techniques for TP53 mutation analysis. Material and methods: Thirty-nine cases of oral squamous cell carcinoma (OSCC) were selected from the Pathology Division of Instituto Nacional de Câncer (Inca). The DNA extraction method used was the QIAamp® DNA minikit® system. After DNA quantification by spectrophotometry, 250 ng of genetic material obtained from TP53 gene were amplified by PCR for exon 2 and by nested PCR for exon 6. Out of the total sample, 11 cases were selected for exon 2 sequencing. Results: The DNA samples presented mean concentration of 119.74 ± 88.86 ng/µl (28.9-556.4) and purity of 1.69 ± 0.18 (1-1.9). Thirty-three (84.6%) samples were amplified for exon 2, and all samples for exon 6 (39/100%). Readable sequencing data were obtained in 10 (90.9%) cases. Conclusion: Optimization of conditions for TP53 sequencing was obtained, and this will facilitate the analysis of mutations in paraffin-embedded tissues, allowing molecular retrospective studies...

RESUMO

Introdução: O gene TP53 (proteína tumoral p53) é alvo constante de investigação na patogênese do câncer. A imuno-histoquímica fornece dados limitados na análise de p53 no processo da carcinogênese bucal e o sequenciamento de TP53 pode contribuir nessa investigação. Contudo, a obtenção de ácido desoxirribonucleico (DNA) com qualidade para amplificação e livre de contaminação pode constituir uma tarefa difícil na utilização de material parafinado. Objetivo: Padronizar as técnicas de extração de DNA, amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para a análise de mutações em TP53. Material e métodos: Foram selecionados 39 casos de carcinomas de células escamosas bucal da Divisão de Patologia do Instituto Nacional de Câncer (Inca). O DNA foi extraído utilizando o sistema comercial QIAamp® DNA minikit®. Após quantificação do DNA por espectrofotometria, 250 ng de amostra foram amplificados pela técnica de PCR para o éxon 2 e por nested PCR para o éxon 6 do gene TP53. Da amostra total, 11 casos foram selecionados para a padronização da reação de sequenciamento do éxon 2. Resultados: As amostras de DNA apresentaram concentração média de 119,74 ng/µl ± 88,86 (28,9-556,4 ng/µl) e pureza de 1,69 ± 0,18 (1-1,9). Do total das amostras analisadas, 33 (84,6%) foram amplificadas para o éxon 2, e todas (39/100%), para o éxon 6. No sequenciamento do éxon 2 obtiveram-se sequências passíveis de leitura em 10 (90,9%) casos. Conclusão: A otimização das condições para o sequenciamento de TP53 foi obtida, o que facilitará a análise de mutações em tecidos parafinados, permitindo...