Ferramentas proteômicas na identificação de novos alvos antigênicos na proteína M do Histoplasma capsulatum e aplicação em ensaios imunoenzimáticos / Proteomic tools to identify new targets in the M protein antigen of Histoplasma capsulatum and application to immunoassays

RESUMO

A histoplasmose é uma infecção que apresenta amplo espectro clínico, variando desde forma leves, a graves e disseminadas. O diagnóstico da histoplasmose baseia-se nos aspectos clínicos, radiológicos e epidemiológicos. A confirmação se dá pelo isolamento e identificação do Histoplasma capsulatum através de procedimentos microbiológicos. [...] O antígeno M obtido do extrato antigênico histoplasmina é considerado um antígeno imunodominante para produção de anticorpos, sendo reconhecido em cerca de 90 porcento dos soros dos pacientes com histoplasmose, sendo assim nosso grupo vem trabalhando a vários anos em estudos para um melhor conhecimento desta molécula e aplicação no diagnóstico.Um Modelo molecular do antigeno M foi desenvolvido através de sua sequência, tendo então confirmada sua natureza biológica como catalase, sendo observado também que esta molécula apresentava regiões comuns bem como especificas quando comparadas a catalases de organismos eucariotas. No presente estudo procuramos determinar a presença de possíveis epitopos antigênicos na proteína M empregando ferramentas proteômicas, para posterior emprego em ensaios imunoenzimáticos. Para tal foi utilizada a combinação da técnica de coimunoprecipitação com espectometria de massas e posteriormente a técnica de Spot synthesis. Com o emprego do anticorpo monoclonal (mAb 1A7) produzido contra a proteína M recombinante foi possível detectar uma sequência que foi comum as duas metodologias empregadas (PTKIIPEELVPFTP). Esta sequência encontra-se localizada na região onde em estudos anteriores por análise in silico foi apontada como a região mais antigênica desta molécula. Foi realizada a síntese desta sequência, e diferentes desenhos foram utilizados, extensão de resíduos de lisina e adição da molécula de biotina em ambas as extremidades, carboxi e amino terminal, bem como a síntese da sequência sem adição de outras moléculas. Diferentes desenhos de ensaios imunoenzimáticos foram realizados, um ELISA empregando microesferas carboxiladas, ELISA indireto empregando placas de microtitulação revestidas com estreptoavidina e um ELISA sandwich. A sequência não apresentou resultados satisfatórios nos diferentes ensaios. Observamos que apenas no ensaio onde utilizamos o peptídeo ligado a molécula de biotina 1-a e 1-b, foi possível obter um poder discriminatório entre o grupos de pacientes com histoplasmose e o grupos de indivíduos hígidos, o ponto de corte foi obtido pela media das DOs das amostras de indivíduos hígidos mais duas vezes o desvio padrão, onde este teste apresentou uma boa sensibilidade(100 - 95 porcento), porém a especificidade encontrada não foi satisfatória (27 - 20 porcento). Estes resultados não foram concordantes com a análise feita in silico da sequência sintetizada. O antígeno M recombinante foi testado em um ELISA de captura de antígeno, onde os resultados preliminares apresentaram-se promissores necessitando de novos testes para avaliarmos parâmetros como sensibilidade e especificidade.

ABSTRACT

Histoplasmosis is a worldwide distribution infection with several clinical spectrum, from asymptomatic to severe and disseminated disease. The diagnosis of histoplasmosis is based onclinical, radiological and epidemiological findings. The laboratory diagnosis of histoplasmosis is based on fungus isolation by culture, direct examination in tissue or other clinical specimens. However, such procedures have limitations and are time-consuming. For these reasons serological tests play an important role on presumptive diagnosis. [...] The M antigen is obtain by the antigenic extract histoplasmin and is considered as an immunodominant antigen recognized by 90 percent of sera from patients with histoplasmosis, For a better understanding of the molecule biological nature and its application in diagnosis methodologies our group has been working for several years. The molecular analysis of the M antigen was based on the sequence protein and confirmed as a catalase. It was also observed that this molecule showed specific and common polypeptide regions when compared to catalases from others eukaryotic organisms. In this study we evaluated the possible presence of antigenic epitopes in the M protein sequence that could represent potential candidate as diagnostic markers for histoplasmosis. For this reason we used the combining co-immunoprecipitations and mass spectrometry and spot synthesis technique. The application of a monoclonal antibody against to the M antigen (mAb 1A7) produced by our group allowed the detection of a same sequence in both employed methodologies (PTKIIPEELVPFTP). This was synthesized with different conformations, addition lysine residues and biotin molecules in both amino and carboxy terminal regions. Different immunoassays were performed, carboxylated microspheres, ELISA indireta with microplate coated with streptoavidin and ELISA sandwich. The sequence did not show good specificity and sensibility in different tests. A good discriminatory power was possible when the peptide biotin molecule bind (P1-a and P1-b) was used in serum samples from groups of histoplasmosis patients and healthy controls. This test showed a high sensitivity (100-95 percent), however the specificity was not satisfactory (27-20 percent) respectevily. The ELISA´s cut-off points were established as the mean of absorbances plus two standard deviation of the healthy controls. The immunoassay´s results were discordant when compared on in silico analysis using as antigen the synthesized sequence. In another approach, the M antigen was tested in an antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) and promising results were observed, but further studies must be done in order to evaluate parameters such as sensitivity and specificity.