Aplicabilidade da técnica de PCR em tempo real para caracterização de espécies de Leishmania / Aplicability of real time PCR technique for leishmania species characterization

RESUMO

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é causada por protozoários, do gênero Leishmania, envolvidos em um complexo ciclo biológico. No Brasil, sete espécies estão envolvidas com a etiologia da doença, distribuídas em todas as regiões geográficas e responsáveis por diferentes manifestações clínicas. Diante disso, o diagnóstico em conjunto com a identificação da espécie é de grande importância clínico-terapêutica. Este trabalho tem por objetivo avaliar a aplicabilidade da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para identificação de espécies de Leishmania envolvidas com a etiologia da LTA. Foram realizados ensaios de qPCR para padronização da Temperatura de melting (Tm) utilizando cepas de referência de diferentes espécies de Leishmania. Após o diagnóstico em amostras de sangue de animais domésticos utilizando a qPCR, as amostras positivas foram analisadas através de suas Tm, e os produtos de qPCR foram purificados e sequenciados. Dez amostras previamente caracterizadas por isoenzimas, também foram analisadas através da Tm. Ainda como teste de referência, foi padronizada uma Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizando as cepas de referência e testada nas amostras. Através da padronização da Tm das espécies, foram criados dois intervalos de análise 1 (Tm = 78-79,99°C), que compreende Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (V.) shawi; e 2 (Tm = 80-82,2°C), que compreende Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) mexicana. Um total de 223 amostras positivas foi analisado, destas, 58 incluídas no intervalo 1 e 165 no intervalo 2. O sequencimento de 94 destas amostras foi correspondente à L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis e L. (V.) guyanensis. A RFLP em 173 amostras identificou 167 L. (V.) braziliensis, 05 L. (L.) mexicana e 01 L. (V.) panamensis...

ABSTRACT

The American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) is caused by protozoa of the genus Leishmania, involved in a complex biological cycle. In Brazil, seven species are involved in the etiology of the disease, distributed in all geographic regions and responsible for different clinical manifestations. Therefore, the diagnosis together with the identification of the species is of great clinical and therapeutic importance. This work aims to evaluate the applicability of the technique of real-time quantitative PCR (qPCR) for the identification of Leishmania species involved in the etiology of ACL. qPCR assays for standardizing the melting temperature (Tm) using reference strains of different species of Leishmania were performed. After the diagnosis on blood samples of domestic animals using the qPCR positive samples were analyzed by their Tm and qPCR products were purified and sequenced. Ten samples previously characterized by isoenzymes were also analyzed by Tm. Also as a reference test was standardized as Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) using the reference strains and tested on samples. Through standardization of Tm species two ranges of analysis were created 1 (Tm = 78-79,99°C), comprising Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (V.) shawi; and, 2 (Tm = 80-82,2°C), comprising Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) mexicana. A total of 223 positive samples were analyzed, of these, 58 included in the range 1 and 165 in the range 2 to 94 and the sequence of these samples corresponded to L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis and L. (V.) guyanensis. By RFLP in 173 samples were identified 167 L. (V.) braziliensis, 05 L. (L.) mexicana and 01 L. (V.) panamensis The analysis of Tm of the ten samples characterized by isoenzymes showed 80% agreement (p = 0.6499) between the gold standard (isoenzymes) and intervals developed in this study...