Construção, clonagem e expressão do fragmento B da toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae (cepa PW- 8) em Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau / Construction, cloning and expression of the fragment B of diphtheria toxin from Corynebacterium diphtheriae (strain PW-8) in Mycobacterium bovis BCG Moreau sub-strain

RESUMO

A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado...

ABSTRACT

The diphtheria vaccine currently used in Brazil (DTP), despite its history of high efficacy in the prevention of diphtheria, is associated with episodes of toxicity and vaccine reactogenicity in the vaccinee, resulting from the presence in the vaccine of residual proteins derived from the production process or detoxification. Strategies for the development of new vaccines more effective and economically viable against diphtheria have been the subject of intense investigation. The alternative proposed by our group is the use of the vaccine against tuberculosis (Mycobacterium bovis BCG Moreau sub strain) as a vector for the gene that encodes the 58.3 kDa fragment B of the diphtheria toxin (DTB). In our project the dtb gene was cloned into the bifunctional vector pUS977 for cytoplasmic expression and recombinant BCG (rBCG) clones, selected after transformation of BCG, were tested for expression of the DTB polypeptide and antigenicity against polyclonal antibodies anti- diphtheria toxoid by immunoblotting. The integrity and identity of the DNA sequence encoding the dtb gene carried by the plasmid construct pUS977dtbPW8 was confirmed by DNA Sequencing and Analysis of Similarity. The immunogenicity of the rBCG expressing the DTB was investigated in BALB/c mice and the results revealed a specific seroconversion (IgG)...