Uma nova metaloendopeptidase da pele do Bufo paracnemis que inativa hormônios peptídios / A new Bufo paracnemis skin metalloendopeptidase that inactive peptide hormones

RESUMO

Uma nova metaloendopeptidase (Bpase) foi purificada até a aparente homogeneidade, das secreções das glândulas granulares da pele do anfíbio Bufo paracnemis, obtido de uma população de animais provenientes do município de São Gonçalo - Ce. A enzima isolada possui um peso molecular aparente de 50 KDa e foi totalmente inibida por o-Fenantrolina (1mM), EDTA (10mM), EGTA (10mM), Ditiotreitol (DDT) (10mM). Essa enzima mostrou-se resistente a inibição pelo fosforamidon, um inibidor clássico da NEP, ao captopril, inibidor da enzima conversora de angiotensina, bem como aos demais inibidores relacionados a outras classes de peptidases, como inibidores tiol, serina e carboxil. O pH ótimo para a atividade da enzima situou-se em 7,25 o que reforça a sugestão da enzima ser uma endopeptidase neutra. A Bpase hidrolisou os hormônios peptídicos bradicinina (Km = 30,2 μM; Vmáx/ Km = 0,06 x 10-5 .L.min-1), substância P (Km = 12,3 μM; Vmáx/ Km = 0,27 x 10-5 .L.min-1) e ANF (Km = 35 μM; Vmáx/ Km = 0,107 x 10-5 .L.min-1) e diversos peptídios opióides tais como Dinorfina A (Km = 2,38 μM; Vmáx/ Km = 2,23 x 10-5 .L.min-1), Dinorfina A (1-8) (Km = 13,10 μM; Vmáx/ Km = 6,97 x 10-5 .L.min-1) B (Km = 6,74 μM; Vmáx/ Km = 6,52 x 10-5 .L.min-1), Leu-encefalina (Km = 7,29 μM; Vmáx/ Km = 4,25), Met-encefalina (Km = 4,48 μM; Vmáx/ Km = 5,36 x 10-5 .L.min-1), α-neoendorfina (Km = 6,51 μM; Vmáx/ Km = 4,5 x 10-5 .L.min-1). A enzima mostrou uma especificidade pelas ligações no lado amino de aminoácidos hidrofóbicos (P1'), clivando as ligações peptídicas preferencialmente entre dois aminoácidos hidrofóbicos quando presentes, como foi observado ocorrer clivagens entre Fen-Leu e Gli-Fen. Uma vez que, as constantes catalíticas (Km e Vmáx/ Km) dos peptídios opióides clivados pela enzima foram superiores aos outros peptídios naturais estudados, utilizou-se uma série de substratos fluorescentes com sequências opióides naturais para melhor se conhecer a especificidade da Bpase...