Caracterização funcional in vitro de variantes no gene PCSK9 identificadas em pacientes com Hipercolesterolemia Familial / In vitro functional characterization of PCSK9 variants identified in patients with Familial Hypercholesterolemia

RESUMO

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença genética do metabolismo das lipoproteínas, caracterizada pelo aumento do colesterol plasmático, transportado principalmente pela lipoproteína de baixa densidade (LDL). A HF é causada principalmente por mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As mutações conhecidas na PCSK9 podem levar ao aumento ou diminuição da função proteolítica da proteína, as quais são associadas ao aumento ou diminuição da LDL-c plasmática, respectivamente. Com o projeto genoma humano surgiram novos métodos de sequenciamento, o que resultou em um grande número de novas variantes genéticas relacionadas à HF. Entretanto, os mecanismos pelos quais essas variantes influenciam na concentração do colesterol e sua interferência na resposta terapêutica não estão totalmente elucidados. O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro o efeito de variantes na região codificadora e reguladora do gene PCSK9 identificadas em pacientes HF utilizando sequenciamento de nova geração. Para a caracterização funcional das variantes na região codificadora da PCSK9, primeiramente foi avaliado o impacto dessas variantes na interação PCSK9-LDLR via Docking molecular. Células HEK293FT foram transfectadas com as diferentes construções da PCSK9, e posteriormente, foram utilizadas em ensaios para avaliar a atividade do LDLR e a internalização de LDL por citometria de fluxo. Para as variantes na região reguladora da PCSK9, foi realizado uma predição in silico do possível efeito de variantes na região 3UTR na ligação de miRNAs. A avalição da interação entre os miRNAs preditos, e a região 3UTR da PCSK9, e o possível impacto nessa interação na presença de variantes na região 3UTR, foi realizada em células HEK293FT transfectadas com um plasmídeo contendo a 3UTR da PCSK9 e um gene repórter da Gaussia luciferase, juntamente com um plasmídeo de expressão contendo os miRNAs de interesse. Foi também estudado o efeito dos miRNAs preditos sobre a expressão, RNAm e proteína, da PCSK9 via RT-qPCR e Western blot, em células HepG2. Foram identificadas 9 variantes na região codificadora da PCSK9, e duas, E32K e R469W, foram selecionadas para os ensaios posteriores. Para a R469W foi observada uma possível alteração conformacional a qual poderia aumentar a afinidade da PCSK9 pelo LDLR. Para a E32K, uma possível associação com HF foi observada em uma família brasileira com ascendência japonesa. As variantes E32K e R469W apresentaram uma redução na atividade do LDLR de 5 e 11%, respectivamente em comparação a PCSK9-WT. Entretanto, não foram observadas reduções estaticamente significativas na atividade do LDLR e na internalização da LDL em células transfectadas com ambas as variantes. Dez variantes foram encontradas na região 3UTR da PCSK9, entre elas três foram selecionadas por impactar a ligação de quatro miRNAs. Nossos dados demonstraram uma redução significativa na expressão da PCSK9 em células HepG2 transfectadas com os miR-4721 e miR-564 (p=0,036 e p=0,010, respectivamente). Porém, não foi observada diferenças na expressão da luciferase em células transfectadas com esses miRNAs, não sendo possível validar a interação miRNA-RNAm. As variantes no gene PCSK9 identificadas no nosso estudo podem não explicar individualmente o fenótipo HF, mas podem contribuir para a severidade da doença juntamente com outras variantes em outros genes

ABSTRACT

Familial Hypercholesterolemia (FH) is a genetic disorder of lipoprotein metabolism, characterized by elevated plasma cholesterol levels, mostly carried by low-density lipoprotein (LDL). FH is mainly caused by mutations in three genes, LDLR, APOB, and PCSK9. Gain-of-function mutations in PCSK9 reduce LDL receptor levels, resulting in high levels of LDL cholesterol in the plasma. Loss-of-function mutations lead to higher levels of the LDL receptor, resulting in lower LDL cholesterol levels. The Human Genome Project led to a faster technological development related to sequencing methods, which allowed identifying many novel variants associated with FH. However, the mechanisms by which these variants influence cholesterol levels and their interference in therapeutic response are not fully understood. The aim of the present study was to perform an in vitro characterization of the effect of PCSK9 variants identified in FH patients using Next-Generation Sequencing. For the functional characterization of variants in the coding region of PCSK9, the impact of these variants on PCSK9-LDLR interaction was evaluated by molecular docking. HEK293FT cells were transiently transfected with different PCSK9 constructs, and the amount of cell surface LDLR and LDL internalization were determined by flow cytometry. For the variants in PCSK9 3UTR region, an in silico prediction of PCSK9 3UTR variants in miRNA seed regions and target sites was performed. To determine whether the predicted miRNAs directly interact with PCSK9 3UTR region, HEK293FT cells were co-transfected with a vector containing a PCSK9 3'UTR region and a Gaussia luciferase reporter gene, together with an expression plasmid containing the miRNAs of interest. The effect of the predicted miRNAs on the expression of PCSK9 was evaluated using RT-qPCR and Western blot in HepG2 cells transiently transfected with miRNA mimics. Nine missense variants were identified in PCSK9 gene. E32K e R469W were chosen for further analysis. For R469W, a possible conformational change was observed that could increase the affinity of PCSK9 for LDLR, when compared to the wild-type. For E32K, a possible association with FH in a Brazilian family with Japanese ancestry was observed. E32K and R469W had a 5% and 11% decreased level of cell surface LDLR, respectively, as compared with WT-PCSK9. However, no significant reduction in the number of cell surface LDLR and LDL internalization was observed in transfected cells for both variants. Ten variants were found in PCSK9 3'UTR region, of which three were selected for affecting the binding of four miRNAs. Our data demonstrated a significant downregulation of PCSK9 in cells transfected with miR-4721 and miR-564 miRNA mimics, compared to cells transfected with a scramble control (p=0,036 and p=0,010, respectively). However, no differences in luciferase expression were observed in cells transfected with these miRNAs, therefore, it was not possible to experimentally validate miRNA-mRNA interaction. PCSK9 variants found in our study may not fully explain FH phenotype but may contribute to the severity of the disease together with other variants in other genes