Estudo funcional da proteína MRCK-ß em adenocarcinomas colorretais metastáticos ou não / Functional study of the MRCK-ß protein in metastatic or non-metastatic colorectal adenocarcinoma

RESUMO

Introdução: O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia de origem epitelial e abrange tumores de cólon e reto em homens e mulheres. É uma doença tratável e frequentemente curável quando na ausência de extensão para outros órgãos. No entanto, aproximadamente 50% a 60% dos pacientes diagnosticados com CCR irão desenvolver metástases que são mais comumente encontradas em fígado e pulmão. MRCK-ß mediada por Cdc42 tem um papel importante na migração e metástase devido a sua capacidade de promover rearranjos do citoesqueleto. E ROCK2, mediada por RhoA também esta relacionado à capacidade de invasão e migração. Objetivo: Avaliar a importância das proteínas MRCK-ß e Cdc42 no processo de migração celular e formação de metástases em adenocarcinomas colorretais através estudos de expressão gênica, expressão proteína e estudos funcionais em linhagens celulares. Materiais e Métodos: 60 casos com CCR que desenvolveram metástases e 48 casos que não desenvolveram metástase foram selecionados e seu material parafinado foi resgatado para avaliação proteica. Imunoistoquímica foi realizada para os marcadores anti-MRCK-ß, anti-Cdc42 e anti-ROCK2, as reações foram analisadas de forma manual através do sistema Envision FLEX/HRP (DAKO®). A partir de amostras do banco de tumores, presentes no Biobanco da Patologia Investigativa do AC Camargo Cancer Center, foram extraídos RNAs para avaliar a expressão gênica de Cdc42 e MRCK-ß. A superexpressão proteica de MRCK-ß foi avaliada através da linhagem celular SW480 e foram realizados ensaios de migração por transwell e a inibição da expressão foi realizada na linhagem HCT116. Resultados: Cdc42 e ROCK2 mostraram maior expressão nos tumores não metastáticos e MRCK-ß nos tumores metastáticos, todos com um valor p < 0,001. Entre os tumores primários e suas metástases, ROCK2 mostrou estar mais expresso no tumor primário (p = 0,042). Os marcadores também foram avaliados através do qRT-PCR e não mostram correlação com a expressão imunoistoquímica. Os ensaios de migração mostraram que quando ocorre a superexpressão de MRCK-ß as células apresentam maior capacidade de migração (p = 0,017). Conclusões: MRCK-ß mostrou expressão apenas entre os tumores metastáticos e maior expressão na linhagem HCT116, que possui um maior potencial metastático. Quando a superexpressão de MRCK-ß foi ampliada na linhagem SW480, foi avaliado que a capacidade de migração celular é aumentada indicando ser um potencial marcador de metástase em câncer colorretal (AU)

ABSTRACT

Introduction: Colorectal cancer (CRC) is a neoplasia of epithelial origin and covers tumors of the colon and rectum tumors in men and women. It is a treatable and often curable disease when in the absence of extension to other organs. However, approximately 50% to 60% of patients diagnosed with CRC will develop metastases that are most commonly found in the liver and lung. MRCK-ß mediated by Cdc42 plays a role in migration and metastasis due to its ability to rearrangements of the cytoskeleton. And ROCK2, mediated by RhoA is also related to the capacity of invasion and migration Aim: To evaluate the importance of MRCK-ß and Cdc42 proteins in the process of cell migration and formation of metastases in colorectal adenocarcinomas through studies of gene expression, protein expression and functional studies in cell lines. Materials and Methods: 60 cases of CRC that developed metastases and 48 cases that did not develop metastasis were selected and their paraffin material was rescued. Immunohistochemistry was performed for the anti-MRCK-ß, anti-Cdc42 and anti-ROCK2 markers, reactions were analyzed manually using the Envision FLEX / HRP (DAKO®) protocol. RNAs samples from the tumor bank, presents on Biobank of Investigative Pathology of AC Camargo Cancer Center, were extracted to evaluate the gene expression of Cdc42 and MRCK-ß. The overexpression of the protein of MRCK-ß was evaluated through the SW480 cell line and transwell migration assays were performed and the inhibition of expression was performed in the HCT116 Results: Cdc42 and ROCK2 showed higher expression in non-metastatic tumors and MRCK-ß in metastatic tumors, all with a p-value of <0.001. Among primary tumors and their metastases, ROCK2 showed to be more expressed in the primary tumor (p = 0.042). The markers were also evaluated through qRT-PCR and did not show correlation with immunohistochemical expression. The migration assays showed that when MRCK-ß overexpression occurs the cells have a higher migration capacity (p = 0.017). Conclusions: MRCK-ß showed expression only among metastatic tumors and greater expression in the HCT116 cell line, which has a higher metastatic potential. When overexpression of MRCK-ß was amplified in the SW480 cell line, it was evaluated that the cell migration capacity was increased indicating to be a potential marker of metastasis in colorectal cancer (AU)