Avaliação de survivina e XIAP e dos fatores de transcrição foxo3a e foxM1 como potenciais biomarcadores de quimiorresistência no câncer de mama / [Evaluation of survivin and XIAP and transcription factors foxo3a and foxM1 as potential chemoresistance biomarkers in breast cancer]

RESUMO

O câncer de mama é a neoplasia que apresenta maior mortalidade entre as mulheres ao redor do mundo, apesar dos avanços na descoberta de novas modalidades terapêuticas e marcadores prognósticos. A resistência ao tratamento quimioterápico é uma das principais causas de falha terapêutica, apontando para a necessidade da identificação de biomarcadores preditivos de resposta. Evidências científicas mostram que a superexpressão de FoxM1 e das proteínas antiapoptóticas Survivina e XIAP, bem como a inativação do fator de transcrição Foxo3a, estão associados a quimioresistência e a um prognóstico desfavorável no câncer de mama. Dessa forma, o objetivo desse estudo é avaliar o papel das proteínas Survivina, XIAP, Foxo3a e FoxM1 como potenciais fatores de resistência à doxorrubicina (doxo), quimioterápico amplamente empregado no tratamento no câncer de mama. Nossos dados mostram que a doxo foi capaz de inibir a viabilidade celular nas linhagens celulares derivadas de carcinoma de mama MCF7 (não-invasiva, positiva para receptores de estrogênio e Her2) e MDA-MB-231 (invasiva, triplo-negativa), como avaliado pelo ensaio de MTT. A droga induziu a perda da adesão celular e fragmentação do DNA, como observado pela análise morfológica com quantificação das células não-aderidas e avaliação do conteúdo de DNA por citometria de fluxo. A análise da ativação das caspases-3, -7 e -9 por Western blotting revelou que a doxo induziu apoptose em células com diferentes status de p53. Em paralelo, o tratamento com a doxo resultou na redução dos níveis proteicos e de RNAm de XIAP e Survivina, como avaliado por Western blotting e PCR em tempo real, respectivamente. Entretanto, a indução da superexpressão da Survivina, por transfecção plasmidial, não foi capaz de conferir resistência ao quimioterápico. Corroborando esses resultados, observamos que o silenciamento gênico por siRNA de XIAP e Survivina, isoladamente ou em combinação, não sensibilizou as células à morte celular induzida pela doxo, indicando que tais proteínas não desempenham papel na resistência à droga. Contrariando dados da literatura, a doxo foi capaz de induzir a fosforilação de Foxo3a e Akt e reduzir a expressão de seu alvo transcricional Bim e dos níveis de RNAm de FOXO3A. De maneira consistente, a droga promoveu a translocação de Foxo3a do núcleo para o citoplasma, como examinado por fracionamento subcelular, apontando para a inativação da sua função. Além disso, a expressão do fator de transcrição FoxM1 foi reduzida, mediante o estímulo apoptótico induzido pela doxo. A indução da superexpressão de FoxM1 foi capaz de reverter a sensibilidade das células MDA-MB-231 à doxo, processo que envolveu a indução dos níveis de Survivina e XIAP. O mesmo efeito não foi observado nas células MCF7 superexpressando FoxM1, uma vez que se mantiveram sensíveis ao quimioterápico e apresentaram inalterados níveis de Survivina e XIAP. O conjunto dos nossos dados indica que a via de sinalização oncogênica mediada pelo fator de transcrição FoxM1 é capaz de promover a resistência à doxo e sugere que a combinação clínica de inibidores de FoxM1 com a doxo tem o potencial de sobrepujar a quimiorresistência no câncer de mama, principalmente em tumores triplo-negativos.

ABSTRACT

Breast cancer is the leading cause of deaths in women around the world, despite recent advances regarding novel therapeutic options and identification of prognostic factors. Resistance to therapy is the main cause of treatment failure and still there is no predictive biomarker for response to systemic therapy available. Increasing evidence shows that Survivin and XIAP antiapoptotic proteins and FoxM1 overexpression, as well as the inactivation of Foxo3a transcription factor, are closely associated with chemoresistance and poor prognosis in breast cancer. Thus, this study aimed to investigate Survivin, XIAP, Foxo3a and FoxM1 potential role on resistance to doxorubicin (dox), a chemotherapeutic agent widely used to treat breast cancer. Our data demonstrates that dox inhibited cell viability in the breast cancer derived cell lines MCF7 (non-invasive, Her2 and estrogen receptor positive) and MDA-MB- 231 (invasive, triple-negative), as evaluated through the MTT assay. The drug induced loss of cell adhesion and DNA fragmentation, as examined by morphological analysis followed by quantification of non-adherent cells and flow cytometry DNA content analysis. Western blotting evaluation of caspases-3, -7 and -9 activation revealed that dox induced apoptosis in cells with different p53 activation status. In parallel, exposure to dox resulted in reduction in Survivin and XIAP protein and mRNA levels, as evaluated by Western blotting and real time PCR, respectively. However, when we transfected cells with a Survivin-encoding plasmid, we did not observe a cell death-resistant phenotype. Accordingly, XIAP and Survivin silencing through siRNA, individually or in combination, had little effect on breast cancer cells sensitivity towards dox, suggesting that the drug can induce apoptosis independently of their expression. Contrasting data in the literature, dox treatment induced Foxo3a and Akt phosphorylation and reduced the expression of its transcriptional target Bim and FOXO3A mRNA levels. In agreement, dox-exposed cells displayed Foxo3a expression in cytoplasm, differently from predominantly nuclear Foxo3a observed in untreated cells, as examined through subcellular localization. These data point to dox-induced Foxo3a inactivation in breast cancer cells. In addition, we observed that FoxM1 transcription factor expression was inhibited upon dox-mediated apoptotic stimuli. Importantly, FoxM1 overexpression could counteract apoptosis in MDA-MB-231 cells, along with induction of Survivin and XIAP expression. This effect was not observed in MCF7 cells, which remained similarly sensitive to dox and displayed Survivin and XIAP levels unaltered. Altogether, our results demonstrate that FoxM1 signaling pathway can promote dox resistance and suggest that combining FoxM1 inhibitors with dox has the potential to circumvent chemoresistance in breast cancer, specially in triple negative tumors.