Análise de fatores do controle traducional no carcinoma invasivo da mama e estruturação de metodologia de translatômica para amostras tumorais humanas / Analysis of translational control factors in invasive breast carcinoma and development of a translatomics methodology for human tumor samples

RESUMO

Introdução. O câncer de mama possui uma complexidade singular, apresentando considerável heterogeneidade. Os tumores desta patologia são classificados em subgrupos moleculares para um melhor direcionamento na conduta terapêutica. Entretanto, mesmo entre pacientes de um mesmo grupo existe uma ampla gama de prognósticos diferentes, o que indica a necessidade de mais estudos que possam ampliar nosso conhecimento desta enfermidade. A compreensão de mecanismos moleculares associados aos tumores de mama passa pela identificação de perfis de expressão gênica, tradicionalmente analizados pelos níveis de mRNAs. No entanto, essa abordagem não permite identificar mRNAs alvo do descontrole traducional, o que pode alterar o perfil protéico. De fato, alterações em diversas vias de sinalização que controlam a maquinaria de tradução foram observadas em tumores mamários. Portanto, o estudo do controle traducional permite compreender melhor a biologia da doença e identificar padrões de expressão gênica baseados no mRNA diferencialmente traduzido, contribuindo para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares associados ao câncer de mama. Objetivo. Padronizar e aplicar a identificação de mRNAs diferencialmente traduzidos (translatômica) em tumores de mama e estudar o impacto da expressão diferencial de fatores da maquinaria de tradução nas características clínico patológicas do câncer de mama. Métodos. A separação dos mRNAs diferencialmente traduzidos foi realizada através de perfil polissomal desenvolvido neste projeto. Os mRNAs associados aos polissomos foram isolados e identificados através de sequenciamento com construção de biblioteca single cell (Smart-Seq2). A expressão de fatores de início de tradução foi identificada utilizando imuno-histoquímica. Resultados. Foi desenvolvido um gradiente não-linear de sacarose para o isolamento de polissomos, otimizado para a extração de mRNAs em volume reduzido, permitindo a aplicação em pequenas amostras de tecido tumoral. O isolamento e identificação dos mRNAs associados a polissomos foi realizada em 306 amostras de tumores de mama. Também, reações de imuno-histoquímica foram feitas para determinar a expressão dos fatores de tradução eIF4E, eIF4G e IF5A em uma nova casuística de 278 amostras de todos os grupos moleculares distribuídas em 6 TMAs previamente construídos na instituição. No grupo luminal a expressão dos 3 fatores estava correlacionada, porém sem correlação significativa com proliferação celular. Nas amostras classificadas como triplo-negativas, eIF5A e eIF4E se correlacionam entre si e com a expressão de Ki67, no entanto, eIF4G perde sua correlação com os demais fatores. Conclusões. A padronização da translatômica e sua aplicação em amostras humanas foi realizadas com sucesso. Os resultados da futura identificação dos mRNAS diferencialmente traduzidos poderão orientar a descoberta de proteínas com expressão diferencial, as quais podem ser importantes mediadoras de processos tumorais. Com relação a expressão de fatores de início de tradução, no grupo triplo-negativo, o aumento da expressão dos fatores eIF4E e eIF5A correlaciona-se com o aumento do marcador Ki-67, indicando um possível papel destas proteínas da tradução específica e diferencial de um grupo de mRNAs importantes para este grupo molecular

ABSTRACT

Introduction. Breast cancer has a unique complexity, presenting great clinical heterogeneity. Tumors within this pathology are classified into molecular subgroups to better address therapeutic management. However, even among patients from the same molecyular subgroup there is a wide range of different prognoses, which indicates the necessity of further studies to increase our knowledge on this disease. The comprehension of the molecular mechanisms associated with breast tumors involves the identification of gene expression profiles, traditionally determined by mRNA levels. This approach does not allow the identification of mRNAs targets of translation control, which has a huge impact on the protein profile. In fact, changes in several signaling pathways that control the translation machinery have been observed in mammary tumors. Therefore, the study of translational control allows a better understanding of breast cancer biology and identifies gene expression patterns based on differentially translated mRNA, contributing to clarify molecular mechanisms associated with this disease. Goal. To develop and search for differentially translated (translatomic) mRNAs in breast tumors and to study the impact of differential expression of translation machinery factors on clinical pathological features. Methods. The isolation of differentially translated mRNAs was performed through the polysomal profiling developed in this project. mRNAs associated with polysomes were fractionated and identified by single cell library preparation (Smart-Seq2) and RNA-seq. The expression of translational start factors was evaluated using immunohistochemistry. Results. A nonlinear sucrose gradient was developed from scratch for the isolation of polysomes, optimized for mRNAs extraction in reduced volumes, allowing application of this methodology on small tissue samples. The fractionation and mRNAs associated with polysomes identification was performed on 306 breast cancer samples. Also, immunohistochemistry reactions were performed on a new set of 278 breast samples from all molecular groups distributed in 6 previously constructed TMAs to determine the expression of eIF4E, eIF4G and IF5A translation factors. In the luminal group the expression of the 3 factors was correlated, although without any significant correlation with cell proliferation. eIF5A and eIF4E correlated with each other and with Ki67 expression in triple-negative samples, however, eIF4G lost its correlation with the other factors on this group. Conclusions. The development of a methodology that allows studying translatomics on human samples was successfully performed. The results of future identification of differentially translated mRNAs may guide the discovery of proteins with differential expression that might be important mediators of tumor processes. Regarding the expression of translational factors, on the triple-negative group, the increased expression of the eIF4E and eIF5A factors correlated with increased Ki-67 staining, indicating a possible role of these specific translational proteins on a group of mRNAs important to induce proliferation in the triple-negative breast cancer molecular group