O papel da heme oxigenase-1 na lesão celular desencadeada pelo sulfato de polimixina B em células LLC-PK 'K IND. 1' / The role of heme oxygenase-1 in the cellular injury caused by polymyxin B sulphate on LLC-PK 'K IND. 1' cells

RESUMO

A heme-oxigenase-1 (HO-1) é uma enzima induzível envolvida na degradação do grupo prostético heme, produzindo compostos com funções anti-oxidante, anti-inflamatória, anti-apoptótica e modulatória do sistema imune no rim. A importância de sua indução está associada à resposta adaptativa ao estresse oxidativo e à inflamação envolvidos na gênese da insuficiência renal aguda. O sulfato de polimixina B é um antibiótico usado no tratamento de infecções Gram-negativas e que apresenta um efeito nefrotóxico ainda não completamente elucidado. O objetivo deste estudo foi verificar a viabilidade e apoptose de células LLC-PK1 submetidas ao tratamento com polimixina B, com tempos de exposição diferentes, e pré-tratadas com hemin (indutor de heme oxigenase-1) ou protoporfirina de zinco (inibidor de heme oxigenase-1). Células renais de porco, LLC-PK1, foram cultivadas com polimixina B durante 24, 48 e 72 horas. A apoptose e viabilidade celular foram avaliadas usando diferentes doses do antibiótico Controle (CTL, 0 µM); G1 (12,5µM); G2 (37,5µM); G3 (75µM); G4 (125µM) e G5 (375µM). O hemin (25µM) e a protoporfirina de zinco (10µM) foram administrados uma hora antes da polimixina B. Foram utilizados os métodos Acridine orange/ brometo de etídio (viabilidade) e Hoescht 33342 (apoptose). Os resultados demonstraram redução linear de viabilidade induzida pela polimixina B quando a dose e o tempo de exposição foram aumentados, isto foi confirmado pela variação inversa de apoptose. O hemin aumentou a viabilidade e reduziu apoptose na presença de polimixina B, sugerindo um efeito protetor da HO-1 neste modelo. O efeito observado para a protoporfirina de zinco foi semelhante ao descrito para o hemin. O estudo confirmou a citotoxicidade da polimixina B em células renais e constatou que esse efeito pode ser mediado pela HO-1 considerando o efeito obtido no tratamento com o indutor daquela enzima.

ABSTRACT

The heme oxygenase-1 is a inducible enzyme involved in degradation of the heme prosthetic group, producing compounds with antioxidant, anti-inflamatory, antiapoptotic and immune system modulatory actions. The importance of its induction is linked with the adaptative response to oxidative stress and inflammation involved in the genesis of the acute renal failure. Polymyxin B sulphate is an antibiotic used for the treatment of infections by Gram-negative bacteria and that can induce a nephrotoxic effect that is not completely elucidated yet. The objective of this study was to verify the viability and the apoptosis on LLC-PK1 cells submitted to treatment with polymyxin B and previously treated with hemin (heme oxygenase stimulator - Hm) or zinc protoporphyrin (heme oxygenase inhibitor - ZnPP). LLC-PK1 cells were cultivated during 24, 48 e 72 hours. The apoptosis and the viability were evaluated using different doses of antiobiotic Control(0mM); G1(12,5mM); G2(37,5mM); G3(75mM); G4(125mM) and G5(375mM). The hemin (25mM) and ZnPP (10mM) were given 1 hour before the addition of polymyxin B. It was utilized the Acridine orange/ Ethydium bromide (viability) and Hoescht 33342 (apoptosis) methods. Results demonstrated the linear rise of apoptosis, as the dose and time exposition were increased. This was confirmed by the inverse variation of the cellular viability. The hemin increased the viability and reduced the apoptosis in the presence of polymyxin B, confirming the protector effect of the heme oxygenase-1 in this model. Similar data were obtained when zinc protoporphyrin was added to the culture. This study confirmed the polymyxin B cytotoxicity and that this effect can be mediated by HO-1.