Cuantificación en tiempo real de un conjunto de muestras colombianas de relevancia histórica mediante la detección de un fragmento corto de la región hipervariable II del ADN mitocondrial

RESUMEN

Introducción. A diferencia de otro tipo de investigaciones, el análisis de ADN antiguo (ADNa) requiere la implementación de condiciones metodológicas y de infraestructura especializadas que garanticen la autenticidad de los resultados. Uno de los criterios de autenticidad para este tipo de muestras es la cuantificación del material genético, en la cual es común el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, por su sensibilidad y especificidad. La implementación de estas metodologías y de las condiciones necesarias para el cumplimiento de los requisitos de autenticidad hace que este tipo de investigación sea dispendioso y costoso. Objetivo. Generar una estrategia de cuantificación del ADN mitocondrial de muestras seriamente degradadas mediante un sistema sencillo y de fácil implementación. Materiales y métodos. El sistema se basa en el uso de iniciadores que posibilitan la amplificación específica de fragmentos cortos del ADN mitocondrial. La posterior purificación de este fragmento permite generar una curva estándar con concentraciones acordes al estado de degradación de la muestra. Resultados. Se detectó ADN antiguo proveniente de restos óseos y tejidos momificados de diferentes fechas. Además, el sistema permitió detectar la presencia de agentes inhibidores del ADN. Conclusión. La implementación de la estrategia aquí planteada es sencilla, puede reducir los costos de la investigación y, además, permite la detección de ADNa en muestras muy degradadas, así como la discriminación entre las muestras que no poseen material genético y aquellas que presentan agentes inhibidores.

ABSTRACT

Introduction: Unlike other molecular biology studies, the analysis of ancient DNA (aDNA) requires special infrastructure and methodological conditions to guarantee the quality of the results. One of the main authenticity criteria is DNA quantification, where quantitative real-time PCR is often used given its sensitivity and specificity. Nevertheless, the implementation of these conditions and methodologies to fulfill authenticity criteria imply higher costs. Objective: To develop a simple and less costly method for mitochondrial DNA quantification suitable for highly degraded samples. Materials and methods: The proposed method is based on the use of mini-primers for the specific amplification of short fragments of mitochondrial DNA. The subsequent purification of these amplified fragments allows a standard curve to be constructed with concentrations in accordance to the state of degradation of the samples. Results: The proposed method successfully detected DNA from ancient samples including bone remains and mummified tissue. DNA inhibitory substances were also detected. Conclusion: The proposed method represents a simpler and cost-effective way to detect low amounts of aDNA, and a tool to differentiate DNA-free samples from samples with inhibitory substances.