Inibidores epigenéticos como reguladores de linfócitos T CD8+ humanos / Epigenetic inhibitors as regulators of human CD8 T lymphocytes

RESUMO

Linfócitos T CD8 são células chave na resposta antitumoral. Uma vez ativadas, sofrem mudanças epigenéticas, adquirem fenótipos distintos e sua função está ligada ao potencial citotóxico e produção de mediadores inflamatórios. Porém, na resposta antitumoral, tais células encontram-se disfuncionais. Assim, estratégias capazes de reprogramar as células TCD8 podem aumentar sua eficácia. Inibidores epigenéticos são capazes de modular o perfil de células T CD4, mas os efeitos em células T CD8 ainda não estão totalmente esclarecidos. Portanto, buscamos identificar possíveis inibidores epigenéticos que sejam capazes de modular a atividade e o perfil fenotípico de linfócitos T CD8. Para tal, células T CD8 foram isoladas por sorting a partir de PBMC de doadores saudáveis e cultivados em placas de 96 poços na presença de coquetel de ativação (DynaBeads anti-CD3/CD28, IFN- e IL-2 recombinantes) e 1µM de diferentes inibidores epigenéticos (MS023, A485, L-MOSES, A-196, GSKLSD1, A366). Linfócitos T CD8 não estimulados e linfócitos T CD8 ativados na ausência de inibidores epigenéticos foram utilizados como controles. Após 4 ou 8 dias de cultura, as células foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo para avaliação de marcadores ligados à ativação (CD69), função (IFN- e granzima B), diferenciação (CCR7, CD45RA) e exaustão (PD-1, TIGIT). As células foram adquiridas no citômetro de fluxo BD FACSymphony A5, e a análise estatística foi feita através do software GraphPad Prism 9. Realizamos ensaios in vitro nos quais células T CD8 foram ativadas na presença ou não de diferentes inibidores, com um deles apresentando intenso potencial de modular células T CD8 o A485, um inibidor seletivo do bromodomínio p300/CBP. Os nossos dados mostram que o A485 aumentou a ativação celular, evidenciado pelo aumento da frequência de células TCD8+CD69+. Este inibidor também foi capaz de modular o fenótipo de memória das células T, polarizando-as para um perfil TN/TSCM, diferentemente do controle e dos outros inibidores, que induziram um perfil TEM (células T efetoras de memória). Após oito dias, o tratamento com o inibidor A485 resultou em menor frequência de células PD-1+ e de células TIGIT+ em comparação com o controle. De relevância clínica, o inibidor A485 foi capaz de modular células CAR-T anti-CD19 isoladas de produtos de infusão, aumentando a frequência do marcador CD69 e modulando seu perfil fenotípico, menos diferenciado, em comparação ao controle. Além disso, o inibidor A485 potencializou a ação antitumoral das células CAR-T anti-CD19 em ensaios de co-cultura com a linhagem celular Daudi CD19+. Em resumo, os nossos dados mostram que a inibição de p300/CBP induz um perfil TN/TSCM em células T CD8 ativadas e em células CAR-T, potencializando as suas atividades antitumorais. Posto que a retenção do perfil TN/TSCM favorece o controle tumoral, esses achados podem ter implicações clínicas para pacientes com doenças hematológicas e com tumores sólidos.

ABSTRACT

CD8 T lymphocytes are key cells for the induction of antitumor responses. Once activated, these cells undergo epigenetic changes, acquire distinct phenotypes, and their function is linked to the production of cytotoxic and inflammatory mediators. However, these cells are dysfunctional within the tumor microenvironment. Therefore, strategies capable of reprogramming CD8 T cells can enhance their antitumor efficacy. Previous studies have shown that epigenetic inhibitors can modulate the profile of CD4 T cells, but the effects on CD8 T cells are still to be clarified. Thus, we aimed to identify possible epigenetic inhibitors that can modulate the activity and phenotype of CD8 T lymphocytes. To do this, CD8 T lymphocytes were isolated by cell sorting from healthy blood samples and cultured in 96-well plates in the presence of a polyclonal stimulatory cocktail (i.e., anti-CD3/CD28 DynaBeads, recombinant (r)IFN-, and rIL-2) along with 1µM of different epigenetic inhibitors (i.e., MS023, A485, LMOSES, GSKLSD1, and A366). Unstimulated CD8 T lymphocytes and polyclonally-stimulated CD8 T lymphocytes in the absence of epigenetic inhibitors were used as controls. After 4 or 8 days of culture, the cells were analyzed by flow cytometry for the assessment of cell markers related to activation (CD69), function (IFN- and granzyme B), differentiation (CCR7 and CD45RA) and exhaustion (PD-1 and TIGIT). Cells were acquired by the BD FACSymphony A5 cytometer, and statistical analyses were done using the GraphPad Prism 9 software. First, we conducted in vitro assays in which CD8 T cells were activated in the presence or absence of different inhibitors. A485, a p300/CBP bromodomain inhibitor, showed a potent modulatory effect on CD8 T cells. The inhibitor A485 increased T cell activation, observed by the increased frequency of CD69+ CD8 T cells. This inhibitor could also modulate the T cell memory phenotype, polarizing them towards a TN/TSCM profile, unlike the control and the other inhibitors, which polarized them towards to the TEM (effector memory T cells) profile. When the analyses were conducted after eight days of culture, we observed that the treatment with the A485 inhibitor resulted in a lower frequency of PD-1+ and TIGIT+ T cells compared with CD8 T cells activated in the absence of the inhibitor. Of clinical relevance, A485 was able to modulate anti-CD19 CAR-T cells isolated from pre-infusion products by positively regulating the frequency of CD69+ CAR-T cells and modulating their memory phenotype, keeping these cells less differentiated. In addition, A485 potentiated the in vitro antitumor activity of antiCD19 CAR-T cells in co-culture assays with the CD19+ Daudi cell line. In summary, our data show that the p300/CBP inhibition induces the TN/TSCM profile in CD8 T cells and CAR-T cells, thus boosting their antitumor activitiesSince the TN/TSCM phenotype has been shown to be favorable for tumor control, these findings can be of clinical interest for patients with hematological malignancies and solid tumors.