Estudo da eficácia da terapia fotodinâmica, mediada pelos fotossensibilizadores Photodithazine® e Curcumina, sobre biofilmes multi-espécies formados por Streptococcus mutans, Candida albicans e Candida glabrata / Study of effectiveness of photodynamic therapy by Photodithazine and Curcumin photosensitizer against multispecies biofilms formed by Streptococcus mutans, Candida albicans and Candida glabrata

RESUMO

A capacidade de aderência dos micro-organismos a diferentes superfícies, a resistência a medicamentos, bem como a interação entre as espécies visam garantir a sobrevivência e a proliferação dos mesmos, resultando em menor susceptibilidade dos patógenos aos tratamentos e aos procedimentos de desinfecção. Este estudo teve como objetivo avaliar in vitro a eficácia da Terapia Fotodinâmica (PDT) mediada pelos fotossensibilizadores (FSs) Photodithazine® (PDZ) e Curcumina (Cur) sobre biofilmes multi-espécies compostos por Streptococcus mutans, Candida albicans e Candida glabrata. Para isso, o estudo foi divido em três partes 1- avaliação do efeito fotodinâmico das diferentes concentrações de PDZ (100, 150, 175, 200 e 250mg/L) associada à luz LED (660nm/ 37,5J/cm2) na inativação de biofilme multi-espécies formado em fundo de placa de 96 orifícios; 2- avaliação do efeito fotodinâmico quando realizadas uma e três aplicações sucessivas de PDT, mediada por PDZ (175 e 200mg/L) e luz LED (660nm/ 37,5J/cm2) na inativação de biofilmes multi-espécies, formado sobre corposde-prova de resina acrílica. 3- avaliação do efeito fotodinâmico de diferentes concentrações do FS Cur (80, 100 e 120µM) associada à luz LED (455nm/37,5J/cm2) sobre biofilmes multi-espécies cultivados por diferentes períodos (24 e 48h) sobre corpos-de-prova de resina acrílica. Adicionalmente para cada condição avaliada foi verificado o efeito da aplicação isolada de cada concentração dos FSs PDZ e Cur em contato com o biofilme na ausência de luz (P+L-) e o efeito isolado da luz (P-L+). Além disso, foi realizado o grupo controle positivo, no qual o biofilme não esteve em contato com o FS e não foram iluminados com luz LED (P-L-). Após a aplicação dos tratamentos propostos, a viabilidade dos micro-organismos foi avaliada por meio da contagem de colônias (UFC/mL), teste do XTT, determinação da biomassa total e microscopia confocal de varredura laser (MCVL). Os resultados obtidos foram analisados por meio de ANOVA ou Kruskall-Wallis, seguidos dos testes de Tukey ou Dunn, respectivamente. Para o biofilme formado em fundo de placa as concentrações de 175 e 200mg/L de PDZ mostraram maior redução na quantificação de colônias (UFC/mL) e no metabolismo celular (XTT), entretanto não foi verificada redução da biomassa total. Na segunda parte do estudo, três aplicações sucessivas de PDT mediada por PDZ nas concentrações de 175 e 200 mg/L foram mais efetivas quando comparadas a uma aplicação na redução de S. mutans (quantificação de colônias), além da redução no metabolismo celular e biomassa total do biofilme multi-espécie. Na terceira parte do estudo foi verificado que a redução da viabilidade celular (UFC/mL) ocorreu para as três espécies microbianas no biofilme formado por 24 horas sobre corpos-de-prova. No entanto no biofilme de 48h apenas a C. glabrata e S. mutans tiveram redução da viabilidade celular. Além, disso a PDT mediada por Cur foi eficaz para reduzir o metabolismo celular e a biomassa total dos biofilmes formados por 24 e 48 horas. Adicionalmente, para todas as condições experimentais avaliadas após a aplicação da PDT, mediada por PDZ ou Cur, foi verificada maior redução da bactéria do que das cepas de Candida. Além disso, as imagens obtidas por MCVL mostraram que após a PDT, mediada por PDZ ou Cur, houve aumento visual do número de células marcadas com fluorescência vermelha, quando comparado ao grupo controle (P-L-), indicando a ocorrência de dano celular pela aplicação dos tratamentos propostos. Desta forma, pode ser sugerido que a PDT é um tratamento promissor para infecções bucais, sendo eficaz na redução de bactérias e fungos quando organizados em biofilme multi-espécies

ABSTRACT

The ability of adhesion of microrganisms to different surfaces, the drug resistance, as well as the interaction among the species help to ensure the survival and proliferation of these microrganisms and result in lower susceptibility of these pathogens to treatment and disinfection procedures. This study aimed to evaluate the in vitro efficacy of PDT mediated by photosensitizers (FSs) Photodithazine ® (PDZ) and Curcumin (Cur) against multispecies biofilms formed by Candida albicans, Candida glabrata and Streptococcus mutans. This study was divided into three parts 1. evaluation of the effect of photodynamic therapy of different concentrations of PDZ (100, 150, 175, 200 and 250mg / L) associated with the LED light (660 nm / 37.5 J/cm2) in the inactivation of multspecies biofilms formed in 96-well microtiter plates; 2. evaluation of the photodynamic effect of one PDT applications only and three successive PDT applications mediated by PDZ (175 and 200 mg / L) and LED light (660 nm / 37.5 J/cm2 ) in the inactivation of multispecies biofilms, formed on acrylic resin samples; 3. evaluation of the photodynamic effect of different concentrations of Cur FS (80, 100, and 120µM) associated with LED light (455nm / 37.5 J/cm2 ) against multispecies biofilms grown during different periods (24 and 48h) on acrylic resin samples. Additional samples were treated either with FSs (PDZ or Cur) (P+L-) or LED light (P-L+) only. Positive control samples had neither light nor FSs (PDZ or Cur) (P-L-). After applying the proposed treatments, the viability of microrganisms was assessed by Colony Count (CFU / mL), the XTT assay, determination of the total biomass (CV) and confocal laser scanning microscopy (CLSM).The results were analyzed using ANOVA or Kruskal-Wallis test followed by Tukey or Dunn, respectively. For the biofilm formed in 96-well plate, the concentrations of 175 and 200mg/L showed greater reduction in cell viability (CFU/mL) and cell metabolism (XTT), but a reduction in total biomass was not observed. In the second part of the study, three successive applications of PDT mediated by PDZ concentrations of 175 and 200 mg/L showed higher microbial reduction of multispecies biofilm formed on acrylic resin samples than one application for all the proposed tests. In the third part of the study, it was found that the multispecies biofilm formed in 24 hours on acrylic resin sample was more sensitive to PDT than the 48 hours biofilm. After application of PDT mediated by PDZ or Cur, there was a greater reduction in bacteria than the Candida strains for all the test conditions mentioned. Furthermore, the images obtained by CLSM after PDT, mediated by PDZ or Cur, showed that there was an increase visual in the number of cells with red fluorescence when compared to the control group (P-L-), suggesting that there was cell damage through the application of these treatments. Thus, it can be suggested that PDT is a promising treatment for oral infections and is effective in reducing bacteria and fungi when associated in multispecies biofilm