Investigação citogenômica tecidual post-mortem em portadores de malformações congênitas / Post-mortem tissue cytogenomics investigation in patients with congenital malformations

RESUMO

Introdução: As malformações congênitas (MCs) são a segunda causa de mortes fetais e infantis no Brasil e, em grande parte dos casos, a sua etiologia não é bem definida. Devido às consequências clínicas das MCs, alguns pacientes falecem sem tempo hábil para uma investigação etiológica acurada. Dessa forma, a maioria dos casos permanece sem uma confirmação molecular das suspeitas clínicas, dificultando o aconselhamento genético para as famílias. Objetivos: O presente trabalho utilizou técnicas citogenômicas para caracterizar molecularmente a presença de anormalidades no DNA, desde aneuploidias até a variação do número de cópias gênicas (CNVs) em diferentes tecidos de pacientes falecidos portadores de MC encaminhados ao Serviço de Verificação de Óbitos para avaliação anatomopatológica. Casuística e Métodos: Foram avaliadas amostras de 30 pacientes portadores de MC submetidos à necropsia. O DNA foi extraido de diferentes tecidos (cérebro, coração, fígado, pele e diafragma) previamente conservados em RNA later, formol ou emblocados em parafina. Foram utilizadas as técnicas de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) com os kits P095, P064 e P070 (MRC-Holland®), Marcadores Microssatélites (MMS) com o kit MiniFiler (Life Technologies®), a Fluorescence in Situ Hybridization (FISH), a técnica de array (Infinium® CytoSNP-850K BeadChip - Illumina) e o Sequenciamento Bidirecional por Sanger. A interpretação dos resultados foi realizada utilizando os softwares GeneMarker, Coffalyser, BlueFuse Multi, Sequencher e com os bancos de dados Database of Genomic Variants (DGV - http//projects.tcag.ca/variation/), Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (DECIPHER - http//decipher.sanger.ac.uk/), UCSC Genome Bioinformatics (http//genome.ucsc.edu) e Mutation Taster. Resultados: Dos 30 pacientes avaliados, 13 apresentaram alterações patogênicas. Entre eles, oito apresentaram aneuploidias envolvendo...

ABSTRACT

Introduction: Congenital malformations (CMs) are the second leading cause of fetal and infant deaths in Brazil and in most cases the etiology is not well defined. Also, the patients remain without a conclusive diagnostic making difficult the genetic counseling. Objectives: This study applied cytogenomics techniques in order to characterize the presence of DNA abnormalities, as well as, aneuploidies and genomic copy number variations (CNVs) in different tissues from deceased patients with CM from "Serviço de Verificação de Óbitos". Patients and Methods: We evaluated samples from 30 patients undergoing necropsy. The DNA was extracted from different tissues (brain, heart, liver, skin and diaphragm) stored in RNA later, formaldehyde and embedded in paraffin. We performed Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) with P095 kits, P064 and P070 (MRC-Holland®), microsatellite markers (MMS) with MiniFiler kit (Life Technologies), Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), array technique (Infinium® CytoSNP-850K BeadChip - Illumina) and bidirectional sequencing by Sanger. The results was analyzed using different softwares GeneMarker, Coffalyser, BlueFuse Multi Sequencher and databases Database of Genomic Variants (DGV - http//projects.tcag.ca/variation/) Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (Decipher - http//decipher.sanger.ac.uk/), UCSC Genome Bioinformatics (http//genome.ucsc.edu) and Mutation Taster. Results: The results showed 13 patients with pathogenic CNVs, and among them, eight presented aneuploidies involving chromosomes 13, 18, 21, X and Y. Two of them presented intra-tissue mosaicism. Also four patients showed several different microdeletions or microduplications duplication of TYMS gene (18p11.32); deletion of CHL1 gene (3p26.3); deletion of HIC1 gene (17p13.3); deletion of TOM1L2 gene (17p11.2 ). One patient showed a pathogenic missense mutation of g.8535C>G (c.746C > G) in exon 7 from FGFR3...