Análise da heterogeneidade do status mutacional do gene KRAS em carcinoma colorretal primário e metastático / Analysis of KRAS mutation heterogeneity in primary and metastatic colorectal cancer

RESUMO

Introdução: Mutações no gene KRAS são preditoras negativas de resposta ao tratamento com inibidores do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) em Carcinoma Colorretal (CCR) metastático. Questiona-se qual a melhor amostra tecidual para pesquisar a mutação deste gene. O objetivo desse estudo é avaliar a heterogeneidade do status mutacional do gene KRAS entre diferentes áreas do tumor primário e na metástase. Além disso, testar se a detecção das mutações mais frequentes de KRAS são reprodutíveis entre material parafinado e congelado, e ainda avaliar o impacto das porcentagens de células estromais não neoplásicas presentes na amostra tecidual selecionada para extração de DNA. Material e Métodos: DNA de material parafinado do tumor primário e dametastáse foi obtido de 102 pacientes. Mutações nos codons 12, 13 e 61 do gene KRAS foram avaliadas por pirosequenciamento. Para os experimentos comparativos entre material congelado e parafinado 31 casos parafinado com 5 diferentes mutações conhecidas de KRAS foram selecionados baseados na disponibilidade de tecido congelado. A quantificação de células tumorais foi realizada em diferentes áreas do tumor primário em 8 casos através da análise digital de imagens. Resultados: A população de estudo consistiu de 102 pacientes com CCR meta stático. DNA foi extraído de 2 áreas do tumor primário em 20 casos e 3 áreas em 71 casos...

ABSTRACT

Background: Mutations in KRAS are negative predictors of the response to anti-EGR therapies in the treatment of metastatic colorectal cancer. Question raises regarding the best tissue to test for KRAS mutation. The aim of this study is to test the heterogeneity of KRAS mutational status between different areas of the primary lesion and between paired primary CRC and corresponding metastasis. Another objective is to examine whether the frequently described types of KRAS mutations found in CRC are reproducible between formalin fixed-paraffin embedded tissue (FFPET) and frozen tissue (FT) using the pyrosequencing method, and additionally to test the impact of the percentage of tumor cells in the tissue sample regarding the quantification of the mutated allele. Design: DNA from two or three areas from the primary tumor and from one area of the metastatic tissue was obtained from FFPET from 102 metastatic CRC patients. KRAS codons 12, 13 and 61 mutations were analyzed by pyrosequencing. From frozen versus FFPET experiments, 31 previously sequenced FFPE T cases presenting 5 different mutations KRAS gene were selected based on the availability of paired frozen tissue in A.C.Camargo Center Biobank. Quantification of percentage of tumor cell was performed in different areas of the primary tumor in 8 cases by digital analysis. Results: The study population consisted of 102 metastatic CRC patients. DNA extracted from 2 areas in 20 cases and 3 areas in 71 cases. Only one of the patients showed intratumor heterogeneity and it was regarding KRAS mutation type (one area showed c.35G>T and the other two areas c.35G>A). From this patient, both LN and liver metastasis presented with the c.35G>T mutation. We tested 97 of the patients for heterogeneity regarding paired primary and metastatic tissue, and we found heterogeneity in 2 cases (2,1%)...