Isolamento e caracterização funcional de novos substratos naturais para a endopeptidase 24.15, neurolisina e enzima conversora de angiotensina / Isolation and functional characterization novels natural substrate to endopeptidase 24.15, neurolysin and angiotensina-converting enzyme

RESUMO

Endopeptidase 24.15 (EC 3.4.24.15; ep24.15), neurolisina (EC 3.4.24.16; ep24.16) e enzima conversora de angiotensina (EC 3.4.15.1; ECA) são metalopeptidases envolvidas no metabolismo de neuropeptídeos em vertebrados. Nesse trabalho geramos mutantes cataliticamente inativos para as enzimas ep24.15 e ep24.16, com o objetivo de utilizá-las no isolamento de novos substratos naturais. Experimentos de dicroísmo circular e de ligação com peptídeos conhecidos, utilizando as enzimas selvagens ou inativas recombinantes, confirmaram suas integridades estruturais, bem como a manutenção da capacidade de reconhecer peptídeos. Utilizando as enzimas recombinantes cataliticamente inativas foi possível, com auxílio de cromatografia de exclusão molecular "a seco", isolar vários novos peptídeos presentes no homogenato total de cérebro ou baço de ratos. Estes peptídeos foram separados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), seqüenciados por espectrometria de massa (Q-TOF, MicroMass), e identificados como possíveis fragmentos de proteínas intracelulares, tais como a hemoglobina. Três destes peptídeos (PVNFKFLSH, VVYPWTQRY e LVVYPWTQRY) foram sintetizados e mostraram uma interação com a ep24.15, ep24.16 e ECA, com Ki 's variando entre 1.86 M e 27.76 M. O peptídeo PVNFKFLSH, denominado por nós hemopressina, produziu uma hipotensão dose-dependente em ratos anestesiados, iniciando com doses de 0.001 g/kg. O efeito hipotensivo deste peptídeo foi demonstrado ser potencializado pelo enalapril. Esses dados resultados sugerem que a hemopressina seja uma nova substância vasoativa in vivo. Dessa forma, nossos resultados contribuíram para a identificação de um novo peptídeo vasoativo, bem como para o desenvolvimento de um novo método que permitiu o isolamento de novos substratos naturais para as ep24.15, ep24.16 e ECA...