Diferenciacão específica entre Taenia saginata e Taenia solium por ensaio de PCR e duplex-PCR / Specific discrimination between Taenia saginata and Taenia solium by one step PCR assay and duplex-PCR

RESUMO

Este estudo teve como objetivo a padronizacão de protocolos e a selecão de novos primers para a identificacão espécie-específica de Taenia saginata e Taenia solium através da reacão em cadeia da polimerase (PCR) e duplex-PCR. Inicialmente, foram recuperadas seqüências depositadas no GenBank (acesso nº AB020399 para T. saginata e nº AB020395 para T. solium) referentes ao gene da subunidade maior do ribossomo (LSU RNAr) de tenídeos. A partir do alinhamento das seqüências, um primer genérico denominado TBR-3 (5'-ggcttgtttgaatggtttgacg- 3') foi selecionado de região conservada e, de diferentes regiões semi-conservadas, os primers específicos TBR-4 para T. saginata (5'-cgactcatgaagataaacaaggt-3') e TBR-5 (5'-cggtcgaacagaccataaatct-3') e TBR-6 (5'-gctactacacctaaattctaacc- 3') para T. solium. Os primers foram avaliados quanto à especificidade através da PCR empregando-se DNA total (DNAt) de amostras de cisticercos e proglotes dos parasitos, previamente identificadas por critérios morfológicos. O par de primers TBR-3/TBR-4 permitiu a amplificacão específica do fragmento esperado de 328 pb a partir do DNAt de T. saginata. Os pares TBR-3/TBR-5 e TBR-3/TBR-6 permitiram a amplificacão, respectivamente, dos fragmentos específicos de 310pb e 286pb a partir do DNAt de T. solium. A identidade dos produtos de PCR foi comprovada comparando-se a seqüência dos amplicons obtidos às seqüências de referência do gene LSU RNAr registrado no GenBank (nº AB020399 e nº AB020395). As reacões apresentaram sensibilidade para deteccão de até 1fg do DNAt de T. solium e 0,2fg do DNAt de T. saginata. A combinacão dos primers TBR-3/TBR-4 e TBR3/TBR-6 e o tamanho dos fragmentos gênicos obtidos permitiram o estabelecimento de ensaios de duplex-PCR, eficaz na deteccão simultânea do DNA de T. saginata e T. solium em sistema único de reacão. Os primers utilizados não geraram qualquer produto de amplificacão cruzada quando testados com DNAt de Taenia hydatigena, Taenia taeniaeformis, Hymenolepis diminuta, Anoplocephala magna, Paranoplocephala mamillana e Moniezia expansa, nem frente ao DNAt dos hospedeiros Homo sapiens, Bos taurus e Sus scrofa.