Detecção de Escherichia coli Shiga Toxigênica (STEC) através da amplificação dos genes Stx / Detection of Shiga Toxigenic Escherichia coli (STEC) by amplification of Stx genes

RESUMO

As Escherichia coli Shiga Toxigênicas (STEC) são patógenos emergentes, causadores de diarréia e doenças graves como colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica. As STEC diferenciam-se das demais estirpes de E. Coli pela produção de um ou mais tipos de toxina denominadas toxina Shiga 1 e 2, codificadas pelos genes Stx1 e Stx2, respectivamente. O diagnóstico microbiológico das infecções causadas por STEC é dificultado pelo rápido decréscimo no número de organismos excretados nas fezes após o início dos sintomas e pela diversidade bioquímica e sorológica das estirpes de STEC. O objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo de PCR para a detecção de STEC que seja adequado para a rotina dos laboratórios clínicos. As culturas de estirpes de STEC e outros organismos usados como controles e das amostras de fezes diarréicas foram realizadas em ágar MacConkey e incubadas a 36ºC por 18-24 horas. A extração de DNA foi realizada pelo métoda da fervura. Na PCR foi utilizado um único par de iniciadores, ATACAGAGGGA/GGA/GATTTCGT e CC/ATGATGATGG/ACAATTCAG, capaz de detectar os genes Stx, Stx2 e seus variantes numa mesma reação através da ampliação de um fragmento de DNA de aproximadamente 220 pares de base (pb). A PCR foi realizada em volume de 50ml, contendo 10 ml de DNA, tampão Taq 1X; MgCl2, 1,5mM, dNTP 200mM, iniciadores 1mM cada, Taq DNA polimerase 2U. Empregou-se 1 ciclo de 94ºC por 5 minutos e 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 47ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos, seguidos de 1 ciclo de 72ºC por 10 minutos. Os produtos de amplificação foram detectados através de eletroforese em gel de agarose a 2%. DNA extraído das estirpes de STEC O157H7 (Stx1, Stx2) e O111 (Stx1) permitiu a amplificação de um fragmento de cerca de 220pb, mas nenhum produto de amplificação foi produzido quando o DNA de E. coli ATCC 25922 e de outros organismos controle não produtores de Stx foi utilizado. Foram analisadas 123 cultura de fezes e 3 apresentaram amplificação do fragmento de DNA de cerca de 220 pb, sugerindo a presença de Stx. O protocolo descrito neste trabalho mostrou-se sensível, específico e adequado ao laboratório clínico.