Improvement of XTT assay performance for studies involving Candida albicans biofilms

ABSTRACT

2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide (XTT) reduction assay has been used to study Candida biofilm formation. However, considering that the XTT reduction assay is dependent on cell activity, its use for evaluating mature biofilms may lead to inaccuracies since biofilm bottom cell layers tend to be relatively quiescent at later stages of biofilm formation. The aim of this study was to improve XTT reduction assay by adding glucose supplements to the standard XTT formulation. Candida albicans ATCC 90028 was used to form 24-, 48- and 72-h biofilms. The oxidative activity at 90, 180 and 270 min of incubation was evaluated. The control consisted of standard XTT formulation without glucose supplements, and was modified by the addition of 50, 100 and 200 mM of glucose. The XTT assay with 200 mM glucose showed more accurate and consistent readings correlating with biofilm development at 24, 48 and 72 h. Biofilm growth yield after 180 min incubation, when evaluated with the 200 mM glucose supplemented XTT, produced the most consistent readings on repetitive testing. It may be concluded that glucose supplementation of XTT could minimize variation and produce more accurate data for the XTT assay.

RESUMO

O teste de redução do 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide (XTT) tem sido utilizado para mensurar o desenvolvimento de biofilmes de Candida. Contudo, a reação de XTT é dependente da atividade celular e o seu uso para biofilmes maduros pode ser questionado, considerando que diferentes camadas celulares têm atividade metabólica diferenciadas. O objetivo deste estudo foi avaliar se a adição de glicose à formula de XTT diminuiria a variabilidade na mensuração da atividade metabólica. Biofilmes de Candida albicans ATCC 90028 com tempos de crescimento de 24, 48 e 72 h foram utilizados. Para avaliar o melhor tempo de incubação do XTT, este foi mantido a temperatura de 37 °C, em tempos de 90 180 e 270 min. A fórmula padrão do teste XTT (controle) foi modificada com a adição de 50, 100 e 200 mM de glicose para os grupos experimentais. Os melhores resultados para a incubação foi observado com tempo de 180 min e para a suplementação de glicose à concentração de 200 mM (p<0.001). Concluiu-se que a incubação de 180 min utilizando a suplementação de 200 mM de glicose apresenta resultados de atividade metabólica celular com a menor variação para o estudo de biofilmes de Candida albicans.