Desenvolvimento de métodos moleculares baseados em PCR para a detecção de Schistosoma mansoni / Development of PCR-based molecular methods for the detection of Schistosoma mansoni

RESUMO

Os primers que apresentam como alvo o gene que codifica o rDNA de SSU foram projetados para amplificar com elevada especificidade DNA de Schistossoma mansoni. Cinco sistemas de PCR foram desenvolvidos PCR convencional, nested-PCR (NPCR) convencional, single tube nested PCR (STNPCR), hemi-nested PCR (HNPCR) convencional, e single tube hemi-nested PCR (STHNPCR). A nested-PCR é o modelo mais sensível de PCR. Entretanto, o risco da contaminação é muito alto, já que é necessário ajustar a reação em dois tubos diferentes. O objeto principal deste trabalho é o desenvolvimento de um sistema de STNPCR (patente depositada), visando diminuir o risco de contaminação cruzada, embora mantendo a sensibilidade elevada. O sistema de STNPCR compreendeu 60 ciclos em que concentrações limitadas de “primers” externos participam da PCR sem competir com os primers internos durante os primeiros 15 ciclos da reação, e os primers internos (imobilizados na face interna da tampa do microtubo) fossem introduzidos no sistema de PCR no décimo sexto ciclo por inversão do microtubo. As concentrações dos outros componentes da reação seriam as mesmas usadas em reações padrão de PCR. A avaliação do limite de detecção das PCRs foi realizada utilizando-se quantidades conhecidas de DNA genômico de S. mansoni, que variou de 10 ng a 0,001 fg. O limiar de detecção da PCR simples foi de 10 pg enquanto, a quantidade mínima detectada pelas PCRs nested convencional e STNPCR foram de 0,1 fg e 1 fg de DNA, respectivamente. Por sua vez o limite de detecção da HNPCR convencional também foi de 0,1 fg, e o da STHNPCR foi de 10 fg. Os sistemas desenvolvidos foram testados em pools de caramujos sadios e infectados com S. mansoni, apresentando resultados bastante satisfatórios em relação à especificidade e sensibilidade. A detecção rápida e precisa da infecção do caramujo pelo S. mansoni é de grande importância para o controle da transmissão da esquistossomose, Diante das dificuldades para se realizar esse diagnóstico pelos métodos convencionais. Sendo assim, o presente estudo buscou avaliar a utilidade das abordagens moleculares para identificar focosx de transmissão da esquistossomose por meio da detecção do S. mansoni emm pools de caramujos vetores.