Angiostrongylus costaricensis, A. cantonensis e A. vasorum: diferenciação, detecção no hospedeiro intermediário e filogenia utilizando a PCR-RFLP, Multiplex PCR e sequenciamento da região espaçadora transcrita interna do DNA ribossomal / Angiostrongylus costaricensis, A. cantonensis and A. vasorum: differentiation, tracing the intermediate host and phylogeny using PCR-RFLP, multiplex PCR and sequencing of internal transcribed spacer of ribosomal DNA

RESUMO

Angiostrongylus costaricensis, A. cantonensis e A. vasorum possuem importância humana e veterinária. O exame dos moluscos infectados com esses parasitos é feito após digestão do molusco e sedimentação das larvas (L3). Essas larvas são inoculadas em roedores para obtenção dos vermes adultos que são identificados morfologicamente. Em decorrência dessas dificuldades, desenvolvemos um método molecular para a detecção de larvas desses parasitos utilizando a técnica de PCR-RFLP com iniciadores direcionados para as regiões conservadas da região espaçadora transcrita interna dois do DNA ribossomal (ITS2 do rDNA nuclear) e citocromo oxidase subunidade I do DNA mitocondrial (COI do DNAmt). A enzima de restrição ClaI foi a que forneceu os resultados mais precisos para a primeira região e a RsaI para a segunda. Para a reconstrução filogenética desses helmintos sequenciamos a região ITS2 do rDNA. As topologias das árvores foram ligeiramente diferentes. Na árvore de máxima parcimônia (MP) foi observada a formação de dois grupos I) A. costaricensis, II) A. cantonensis e A. vasorum. Nas árvores de agrupamento de vizinhos (NJ) e máxima verossimilhança (ML) também houve a formação de dois grupos I) A. costaricensis e A. vasorum, II) A. cantonensis. Nas três árvores, o grupo de A. costaricensis foi dividido em dois ramos, separando as populações do Brasil e da Costa Rica, sustentados por alto valor de “bootstrap”. As topologias das árvores e os valores de distância dessas populações sugerem que elas estão se diferenciando, provavelmente, devido à distância geográfica. Os resultados obtidos sugerem a existência de um único gênero Angiostrongylus. De fato, as espécies A. cantonensis e A. costaricensis consideradas por alguns autores como pertencentes ao gênero Parastrongylus mostraram-se distantes entre si e mais próximas de A. vasorum. A partir das sequências desses nematóides, foram desenhados dois iniciadores. Esses iniciadores associados a um par de iniciador direcionado para a região ITS do hospedeiro intermediário, foram utilizados em uma única reação, denominada multiplex-PCR. Foram obtidos perfis específicos para cada nematóide. O amplicon de ITS2 de A. costaricensis do Brasil foi de 400 pb, de A. costaricensis da Costa Rica 480 pb, de A. cantonensis um fragmento duplo de 480-500 pb e de A. vasorum 450 pb. Com essa mesma metodologia detectou-se A. costaricensis em Sarasinula marginata experimentalmente infectada, sendo obtido um amplicon do parasito de 400 pb, associado ao amplicon do molusco de 1000 pb.