Estudo da modulação de proteínas de Trypanosoma cruzi em resposta ao estímulo de TGF-Beta: uma abordagem proteômica / Study of protein modulation in Trypanosoma cruzi in response to TGF-beta stimuli: a proteomic approach

RESUMO

Estudos recentes mostraram que TGF-Beta está envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seu ciclo de vida. Trabalhos anteriores demonstraram que T. cruzi é capaz de ativar TGF-Beta latente, utilizando-o na invasão às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-Beta recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-Beta. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estímulo de TGF-Beta através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-Beta, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-Beta para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. Em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-Beta (1, 5, 15, 30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiva dos perfis em géis bidimensionais de 7 cm com faixa de pH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-Beta foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-alfa, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-Beta. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular disparada por TGF-Beta, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em nossas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-beta a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-Beta promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-Beta, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas.