Avaliação do ciclo celular de células tronco/progenitoras hemopoéticas da medula óssea de camundongos submetidos à desnutrição protéica / Hematopoietic stem/progenitor cell cycle evaluation from bone marrow of malnourished mice

RESUMO

A hemopoese é um processo dinâmico regulado pelo microambiente no qual se situa. O principal tecido hemopoético após o nascimento, a medula óssea, é constituído basicamente por substâncias solúveis, como fatores de crescimento, por uma matriz extracelular (MEC) e por células estromais, além das células hemopoéticas. Esse microambiente indutor íntegro é capaz de regular os processos de sobrevivência, proliferação e diferenciação celular, induzindo a célula a sair de um estado quiescente e entrar em ciclo celular. Contudo, na desnutrição protéica (DP) observa-se redução significativa da celularidade das células hemopoéticas, tanto no compartimento periférico quanto no central, a medula óssea. O comprometimento estrutural do microambinte medular decorrente da desnutrição pode prejudicar a sinalização de indução do ciclo celular, fato este que justificaria o quadro de pancitopenia. Portanto, no presente estudo nos propusemos avaliar o ciclo celular de células tronco/progenitoras hemopoéticas (CTPH) da medula óssea de camundongos desnutridos. Para tanto, utilizamos um modelo murino, sendo a desnutrição induzida a partir de uma ração hipoprotéica. As CTPH foram obtidas por método de depleção imunomagnética e utilizadas para a avaliação do ciclo celular a partir da incorporação de Iodeto de Propídeo (PI) e Laranja de Acridina (AO). Também, foram quantificadas proteínas regulatórias do ciclo celular por western blot e avaliada a expressão de receptores para fibronectina, VLA4 e VLA5. Paralelamente, em modelo ex vivo, avaliou-se a influência de fatores de crescimento e de uma matriz de fibronectina sobre a proliferação das CTPH. Considerando a importância das células estromais na sinalização celular, realizamos o ensaio de CFU-F para a quantificação de células estromais e dos fatores de crescimento secretados. Por fim, avaliamos a eficácia da recuperação nutricional frente às alterações no ciclo celular observadas no modelo de desnutrição...

ABSTRACT

Hematopoiesis is a dynamic process governed by the microenvironment in witch it is located. Basically, the main hematopoietic tissue, the bone marrow, is composed by soluble factors such growth factors, extracellular matrix (ECM) and stromal cells, besides the hematopoietic cells. This intact inducible microenvironment is capable to control cell survival, proliferation and differentiation, inducing cell to exit a quiescent state and enter the cell cycle. However, in protein malnutrition (PM) is observed a significant reduction of hematopoietic cells, both in peripheral and central compartments. The bone marrow structural impairment due to malnutrition could harm the cell cycle signaling, a fact that could justify the establishment of pancitopenia. Therefore, in this study we set out to assess the cell cycle of hematopoietic stem/progenitors cells (HSPC) from bone marrow of malnourished mice. We used a murine model, and malnutrition induced from a low protein diet. The HPSC were obtained by immunomagnetic depletion method and used for the evaluation of cell cycle from the incorporation of propidium iodide (PI) and Acridine Orange (AO). Also, we quantified the cell cycle regulatory proteins by western blot and evaluated the expression of receptors for fibronectin, VLA4 and VLA5. Meanwhile, in ex vivo model, we evaluated the influence of growth factors and a matrix of fibronectin on the proliferation of HSPC. Considering the importance of stromal cells in cell signaling, we performed the CFU-F assay for the quantification of stromal cells and growth factors secreted. Finally, we evaluated the efficacy of nutritional recovery in the face of cell cycle alterations observed in the model of malnutrition. Briefly, we observed an impairment in the cell cycle of HSPC of undernourished mice, with an increase in this cell population in G0/G1 phase. The proteins that induce cell cycle showed a reduced expression whereas the inhibitory proteins showed increased...