Avaliação dos mecanismos envolvidos na inibição da proliferação e na indução da apoptose de linhagem leucêmica pelo óleo de sementes de Pterodon pubescens e suas frações/subfrações / Assessment of the mechanisms involved in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of lineage leukemia by oil seed Pterodon pubescens and its fractions/subfractions

RESUMO

Alterações no ciclo celular e desenvolvimento de tumor encontram-se intimamente ligados. Expressão inadequada e/ou mutações de quinases dependentes de ciclinas, ciclinas e inibidores de quinases dependentes de ciclinas têm sido descritas em vários tipos de cânceres. Portanto, a busca por novas molédulas que têm como alvo eventos em tal via bioquímica tem aumentado ao longo dos anos. Como as plantas são importantes fontes de novas potenciais drogas quimioterápicas, o estudo da fitoquímica, aliado às pesquisas farmacológicas, permite desvendar novas substâncias com potencial anti câncer. Embora efeitos antitumorais tenham sido demonstrados para extratos de Pterodon pubescens, os mecanismos que induzem estes efeitos ainda não estão esclarecidos. Portanto, o presente trabalho teve como objetivos subfracionar a fração hexano do extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens, avaliar alguns mecanismos pelos quais a subfração mais ativa exerce seu efeito antiproliferativo sobre linhagem leucêmica (K562) e tentar identificar compostos envolvidos em tais efeitos. O extrato bruto (OPp) foi obtido por maceração em etanol e posteriormente foi feita uma partição líquido-liquido obtendo-se a fração Hexano (HEX). O subfracionamento por coluna de sílica da HEX resultou em oito subfrações, sendo que a subfração 5 (SF5) a que apresentou menor complexidade por cromatografia gasosa e maior efeito biológico. A citotoxicidade foi avaliada pelo método de redução do sal tetrazol (MTT) e a proliferação celular pela síntese de DNA e curva de crescimento. As fases do ciclo celular e a apoptose foram analisados por citometria de fluxo e a expressão do RNA mensageiro por RT-PCR. A expressão de proteína foi avaliada por Western blotting e a identificação de compostos por CG-EM e 13C-RMN. A SF5 exerceu efeito citotóxico maior do que o extrato bruto, fração HEX e as outras subfrações. Na síntese de DNA e curva de crescimento, a SF5 exerceu efeito inibitório tempo e concentração...

ABSTRACT

Alterations in the cell cycle and tumor development are closely connected. Inapropriated expression and/or mutations of cyclin dependet kinases, cyclins and cyclin kinase inhibitors have been described in many kinds of cancer. So, the search of new molecules that have such biochemical pathway as target has increased over the years. Since plants are important sources of new potential chemotherapic drugs, phytochemical studies combined to pharmacological investigations permit the discover of new substances with potential anti-cancer properties. Although anti tumor effects have been demonstrated for Pterodon pubescens extracts, its mechanisms are still obscure. Therefore, the aims of present work were to subfractionate the HEX fraction of Pterodon pubescens, evaluate some mechanisms by which the most active subfraction exerts its antiproliferative effect on leukemic cell line (K562) and try to elucidate compounds involved in such effects. The crude extract (PpO) was obtained by maceration in ethanol with further liquid-liquid partition yielding the Hexan fraction (HEX). The HEX subfractioning by silica column yielded 8 subfractions, being the subfraction 5 (SF5) that with minor complexity by gas chromatography and greater biological effect. The citotoxicity was evaluated by tetrazolium salt reduction (MTT) and cellular proliferation by DNA synthesis and growth curve. The cell cycle phases and apoptosis were analyzed by flow cytometry and messenger RNA expression by RT-PCR. The protein expression was evaluated by Western blotting and the identification of compounds by GC-MS and 13C-NMR. SF5 induced greater citotoxic effects when compared to crude extract, HEX fraction or the others subfractions. On DNA synthesis and growth curve, SF5 induced time and concentration dependent inhibiory effect, also greater than HEX fraction. The cell cycle analysis showed an increase of cells on G1 phase with consequently reduction of S and G2/M phases. SF5 inhibited the MAP...