Detección molecular y tipificación del virus dengue por RT-PCR y PCR anidada usando oligonucleótidos mejorados / Molecular detection and typing of dengue virus by RT-PCR and nested PCR using degenerated oligonucleotides

RESUMEN

Objetivos: Modificar los oligonucleótidos comúnmente utilizados para la detección y tipificación del virus dengue y evaluar su desempeño sobre ARNs provenientes de muestras clínicas. Materiales y métodos: A partir del alineamiento de secuencias disponibles en el GenBank para la región C-prM/M se determinó la variabilidad genética dentro de cada serotipo del virus dengue, lo cual permitió realizar modificaciones a los oligonucleótidos convencionalmente usados en la tipificación. Tales modificaciones incluyeron la adición y eliminación de nucleótidos en el extremo 3', teniendo en cuenta la posición del codón, así como la inclusión de sitios degenerados en posiciones altamente variables. Los oligonucleótidos se evaluaron a diferentes concentraciones sobre ARNs extraídos a partir de cultivos celulares infectados y posteriormente de sueros de pacientes con diagnóstico probable de dengue. Resultados: Los oligonucleótidos amplificaron específicamente cada serotipo del virus dengue, tanto desde sobrenadantes de cultivo como desde muestras clínicas en prueba piloto. Conclusiones: El rediseño de los oligonucleótidos consideró la variabilidad genética acumulada en más de 15 años, mostrándose experimentalmente su valor y utilidad en la detección y tipificación del virus dengue.

ABSTRACT

Objective: To modify the commonly used primers for detecting and typing of dengue viruses and evaluate their performance on RNAs derived from clinical samples. Materials and methods: To determine the genetic variability within each dengue virus serotype, sequences of C-prM/M region available on GenBank were aligned allowing modifications to the primers conventionally used for virus typing. Modifications include nucleotide insertion and deletion in the 3' end taking into account the codon position, and also the inclusion of degenerated sites in highly variable positions. Primers were evaluated at different concentrations on extracted RNAs from infected cell cultures and subsequently from sera of probable dengue diagnosed patients. Results: All primers specifically amplified each dengue virus serotype from cell culture supernatants and clinical samples in a pilot test. Conclusions: The re-designed primers took into account the accumulated variability during more than 15 years, experimentally showing their value and utility for detecting and typing of dengue viruses.