Desenvolvimento de testes de detecção e quantificação do vírus da Hepatite B em amostras de soro e fluido oral / Development of detection and quantification tests of hepatitis B virus in serum and oral fluid

RESUMO

A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) são importantes para o diagnóstico da infecção, definição e monitoramento do tratamento antiviral. [...] O objetivo deste estudo foi desenvolver um método para quantificação do DNA do HBV em amostras de soro e fluido oral, e avaliar um método qualitativo in house para detecção do DNA do HBV em comparação com métodos comerciais disponíveis no mercado. Amostras pareadas de soro e fluido oral foram obtidas de 116 indivíduos, onde 66 eram reagentes para HBsAg no soro e 50 não apresentavam nenhum marcador sorológico no soro. As amostras de soro foram submetidas a testes imunoenzimáticos para detecção de marcadores sorológicos do HBV (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, anti-HBcIgM, anti-HBe e HBeAg) e ao PCR em tempo real para quantificação do DNA do HBV (COBAS TaqMan HBV, Roche). O DNA do HBV foi extraído utilizando o conjunto de reagentes High Pure Viral Nucleic Acid kit (Roche Diagnostics, EUA) em amostras de soro e RTP® DNA/RNA Virus Mini kit (Invitek, Alemanha) para amostras de fluido oralPara a detecção qualitativa do HBV foi realizada uma PCR com iniciadores para o gene do core, e para detecção quantitativa do HBV foi utilizada a metodologia de PCR em tempo real com sondas TaqMan® na plataforma Line-Gene 9600 (Bioer Serves Life, Canada). Para obtenção da curva de quantificação foi construído um plasmídeo recombinante obtido a partir de amostras padrão do painel de quantificação do HBV (Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, EUA). As seguintes condições da PCR em tempo real foram avaliadas concentração de DNA (5 e 7,5 microlitros), temperatura de hibridização (60°C e 62°C), e números de ciclos (40 e 45 ciclos).

ABSTRACT

The detection and quantification of the DNA of Hepatitis B virus (HBV) are important todiagnose the infection, determine and monitore the antiviral treatment. [...] The objective of this study was to develop a method forquantification of HBV DNA in serum and oral fluid samples, and to evaluate an in housequalitative method for HBV DNA detection compared to commercial methods available inthe market. Paired serum and oral fluid were obtained from 116 individuals, where 66were HBsAg reactive in their sera and 50 did not present any HBV serological marker insera. Serum samples were submitted to enzyme immunoassays for detection of HBVserological markers (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, anti-HBcIgM, HBeAg and anti-HBe) andquantified by commercial real time PCR (COBAS® TaqMan HBV Test, RocheDiagnostics, EUA). HBV DNA was extracted using the commercial kit High Pure ViralNucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, USA) in serum samples and RTP ® DNA / RNAVirus Mini Kit (Invitek, Germany) for oral fluid samples. For HBV qualitative detection itwas employed a PCR using primers for Core gene, and for quantitative detection of HBVit was employed a real time PCR methodology with TaqMan ® probes in the Line-Gene9600 (Bioer Serves Life, Canada) platform. To obtain the quantification curve, arecombinant plasmid was constructed using standard quantification panel of HBV(Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, USA). The following PCR conditions wereevaluated in real time PCR DNA concentration (7.5 and 5 microlitersL), annealing temperature(60° C and 62° C), number of cycles (cycles 40 and 45).