Estandarización de un protocolo para Northern blot no radioactivo usado en la detección de pequeños RNA en células Vero / Standardization of Northern blot non-radioactive protocol used in the detection of small RNAs in Vero line cells

RESUMEN

El interés en la detección, identificación, y caracterización funcional de los pequeños RNAs no codificantes (sRNAs), ha generado la necesidad de optimizar las metodologías comúnmente usadas en su detección, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) y Northern blot, con el fin de que sean más sensibles y específicas. A pesar de la baja sensibilidad del Northern blot, esta metodología continúa siendo de uso común en la detección de sRNAs porque permite detectar el RNA pequeño así como a sus precursores, razón por la cual se usa como una metodología complementaria en este tipo de investigaciones. En este trabajo se describe la implementación de un nuevo protocolo para Northern blot no radioactivo, con modificaciones dirigidas a mejorar su sensibilidad y especificidad. El diseños de la sonda con la tecnología LNA, el marcaje de esta con Digoxigenina y por último la fijación del RNA a la membrana mediante 1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carboniimide (EDC) y finalmente se discuten los fundamentos teóricos de estos cambios.

ABSTRACT

The interest in detection, identification and functional characterization of small non-coding RNAs (snRNAs), has generated the need to optimize the methodologies commonly used in its detection in specificity and sensitivity, The Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) and Northern blot. Even though the low sensitivity of Northern blot, this method continues to be commonly used in the sRNAs, because its capacity to detect the sRNA and its precursor, which is the reason why Northern blot is used as complementary method in this sort of Research. This work describes the implementation of an innovative non-radioactive Northern blot protocol, with modifications that improving the sensibility and specificity, with the discussion of the theoretical foundations of such modifications.