Diagnóstico molecular da malária vivax: precisão e sensibilidade / Diagnosis of vivax malaria: precision and sensitivity

RESUMO

O pronto diagnóstico das espécies plasmodiais para o tratamento correto e efetivo do paciente, impede a transmissão e a reintrodução da malária, assim como o agravamento do estado de saúde do paciente. A metodologia de PCR permite detectar e quantificar parasitos abaixo do limiar de detecção do diagnóstico microscópico. O método de PCR convencional para a detecção de P. vivax padronizado em nosso laboratório é eficaz na detecção da infecção,mas não permite o diagnóstico tão rápido e quantitativo como o da PCR no formato em tempo real assim como também não é conhecida a sua precisão,que compreende os parâmetros de repetibilidade e reprodutibilidade. Dessa forma, o nosso objetivo foi desenvolver um ensaio de PCR em tempo real com os sistemas SYBR Green e TaqMan para o diagnóstico da infecção malárica por P.vivax. O nosso desenho experimental compreendeu a construção da curva padrão com DNA de P.vivax, clonado ou não, para determinar alinearidade; o estabelecimento do limite inferior de detecção e da sensibilidade analítica para aferir a sensibilidade; e a variação intra ensaios (repetibilidade) e entre ensaios, entre operadores e entre equipamentos (reprodutibilidade) para definir a precisão. O desempenho desses parâmetros na padronização das reações de PCRs em tempo real revelou linearidade nos sistemas SYBR®Green e TaqMan®, respectivamente, de 4 x 104a 4 cópias/miL com o DNAclonado e de 1 x 104a 1 parasito/miL com amostra de P. vivax; o limite de quantificação de 1,77 e 0,94 e a sensibilidade analítica de 1,13 e 1,17cópias/miL...

ABSTRACT

The prompt diagnosis of plasmodial species for correct and effective patienttreatment prevents the transmission and reintroduction of malaria, as well asthe worsening of health condition of the patient. The PCR method allowsdetecting and quantifying parasites below the detection threshold of microscopicexamination. The in house conventional PCR method for P. vivax detectionstandardized in our laboratory is effective for detecting infection but does notallow the quantification and a diagnosis as fast as the as the real time PCRformat. Furthermore, its precision, comprising the repeatability andreproducibility parameters, is unknown. Thus, our aim was to develop a realtimePCR assay with SYBR Green and TaqMansystems for the diagnosis ofP. vivax malarial infection. Our experimental design included the construction ofa standard curve with P. vivax DNA, cloned or not, to determine linearity; thesetting of the lower detection limit and analytical sensitivity to measuresensitivity and; the intra assays variation (repeatability) and the oscillationsbetween assays, operators and equipment (reproducibility) to set precision. Theperformance of these parameters in the standardization of real time PCRshowed linearity in SYBR® Green and TaqMan®systems, respectively, from 4 x104to 4 copies/ L with cloned DNA and from 1 x 104to 1 parasite/ L withuncloned P. vivax DNA, quantification threshold of 1.77 and 0.94, and analyticalsensitivity of 1.13 and 1.17 copies/ L...