Avaliação ultraestrutural da mobilização do CD63 em eosinófilos humanos estimulados com eotaxina ou TNF-alfa / Ultrastructural evaluation of the cd63 mobilization in human eosinophils stimulated with eotaxin or tnf-alpha

RESUMO

Os eosinófilos são leucócitos que estão envolvidos em respostasinflamatórias, alérgicas e imunoreguladoras, através da secreção de proteínascatiônicas e citocinas armazenadas em seus grânulos específicos. Os mecanismosde secreção podem ocorrer por (i) desgranulação por piecemeal (PMD),caraterizada pelo transporte mediado por vesículas que brotam dos grânulos elevam os produtos até a superfície celular; (ii) exocitose clássica, caracterizada pelafusão dos grânulos com a membrana plasmática e (iii) citólise, quando os grânulossão liberados após lise celular. O CD63 é uma molécula da família das tetraspaninasque parece atuar como facilitador na secreção de mediadores da inflamação.Entretanto, não existem estudos ultraestruturais que demonstrem a associação deCD63 com processos de secreção de eosinófilos. Este trabalho teve por objetivoinvestigar a mobilização de CD63 e sua correlação com mecanismos de secreçãoem eosinófilos humanos estimulados com mediadores inflamatórios (eotaxina e fatorde necrose tumoral -TNF-alfa). A expressão de CD63 foi investigada na superfíciecelular através de imunofluorescência e em compartimentos subcelulares através deimunomarcação pre-embedding por microscopia eletrônica de transmissão quepermite melhor preservação antigênica e os anticorpos mostram ótimo acesso amicrodomínios celulares com partículas de ouro (1.4 nm) conjugadas a anticorpossecundários. A imunofluorescência mostrou elevada expressão de CD63 nasuperfície celular, mas com padrões diferentes dependendo do estímulo. Enquanto aeotaxina induziu imunomarcação pontual, a expressão de CD63, induzida por TNF-alfa, mostrou-se de maneira difusa, indicando a ocorrência de processos de secreçãodiferentes...

ABSTRACT

Eosinophils are leukocytes involved with inflammatory, allergic andimmmunoregulatory responses through the secretion of granule-stored cationicproteins and cytokines. Secretion can occur by (i) piecemeal degranulation (PMD),characterized by vesicle-mediated transport of products from granules to cell surface;(ii) classical exocytosis, characterized by granule fusion with the plasma membrane e(iii) cytolysis, in which the granule content is released after cell lysis. CD63 is atetraspanin family molecule which seems to act as a facilitator during secretion ofinflammatory mediators. However, there are no ultrastructural studies demonstratingassociation of CD63 with secretory processes of eosinophils. The goal of this workwas to investigate the mobilization of CD63 and its association with mechanisms ofsecretion in human eosinophils stimulated with inflammatory mediators (eotaxin andtumoral necrosis factor-TNF-alpha). Expression of CD63 was investigated at the cellsurface using immunofluorescence technique and in subcellular compartments bypre-embedding ultrastructural immunolabeling which enables better antigenicpreservation. Optimal access of antibodies to cellular microdomains was achievedwith gold particles (1.4 nm) conjugated with secondary antibodies.Immunofluorescence showed high CD63 expression at cell surface, but with differentprofiles, depending on the stimulus. While eotaxin induced a punctualimmunolabeling, expression of CD63, induced by TNF-alpha, was more diffuse, indicatingoccurrence of different secretory processes. Ultrastructural analyses revealed thateotaxin induced PMD, while TNF-alpha led to classical exocytosis. CD63 was detectedmainly on secretory granules. Quantitative analyses showed a significant increase ofthe numbers of CD63-positive granules compared to the unstimulated, control group...