Extração de DNA de biópsias de pele fixadas em formalina tamponada e embebidas em parafina e amplificação por PCR / DNA extraction from formalin-fixed and paraffin-embedded skin biopsies and PCR amplification

RESUMO

Biópsias de pele oriundas dos serviços de diagnóstico da hanseníase podem ser grande fonte de material para estudos retrospectivos em genética humana e do Mycobacterium leprae. No entanto, os procedimentos de fixação e inclusão em parafina podem dificultar a obtenção de DNA de qualidade para amplificação por PCR. Assim, estas amostras requerem protocolos especiais para a extração do material genético. O objetivo deste trabalho é apresentar um método alternativo para extração de DNA com base na combinação de calor e digestão enzimática. Para tanto, os cortes foram aquecidos a 120º C em solução tampão de pH 9,0, submetidos à digestão enzimática com proteinase K e o DNA foi extraído por meio de solução de fenolclorofórmioálcool isoamílico. A amplificação por PCR para as regiões dos genes humanos TNF e LTA foi bem sucedida para 85,4% dos espécimes. Considerando o DNA do M. leprae, obtivemos amplificação em 67,6%, 48,5%, 36,7% e 64,8% para os marcadores TA18, GTA9, TTC e RLEP, respectivamente. Concluímos que este é um método de baixo custo que proporcionou um rendimento satisfatório de DNA de boa qualidade para emprego em PCR a partir de biópsias parafinadas de pele.

ABSTRACT

Skin biopsies from leprosy diagnostic services can be great sources of material for retrospective studies concerning human and Mycobacterium leprae genetic. However, fixation and paraffin embedding procedures make difficult to obtain good quality DNA to PCR amplification. Thus, paraffin-embedded samples require special protocols to DNA extraction. The aim of this paper is to present an alternative method for DNA extraction based on the combination of heat and enzymatic digestion. The sections were heated at 120ºC at pH 9.0, submitted to enzymatic digestion with proteinase K and the DNA was extracted by using phenolchlorophormisoamilic alcohol. PCR amplification for regions in TNF and LTA human genes was successful for 85.4 % of specimens. Regarding M. lepraeDNA, we obtained amplification in 67.6%, 48.5%, 36.7% and 64.8% for the TA18, GTA9, TTC and RLEP markers, respectively. We conclude that this is an inexpensive method which provided a satisfactory yield of a good quality DNA for PCR from paraffin- embedded skin biopsies.