Avaliação da aplicabilidade de polímeros sintéticos na vitrificação de tecido ovariano bovino / Evaluation of the applicability of synthetic polymers in the vitrification of bovine ovarian tissue

RESUMO

A preservação da fertilidade em pacientes com câncer objetiva assegurar a saúde reprodutiva. A criopreservação de tecido ovariano é a única técnica disponível para meninas pré-púberes e para casos em que o tratamento não pode ser adiado. A técnica de vitrificação está associada a uma melhor preservação de fragmentos do córtex ovariano quando comparada ao congelamento lento. Estudos preliminares demonstraram que a combinação de polímeros sintéticos na vitrificação preservou melhor o tecido e os folículos secundários no córtex de ovários de macacos, por serem miméticos às proteínas naturais responsáveis pela proteção conferida a alguns organismos durante o inverno. A técnica de vitrificação associada a polímeros sintéticos é uma alternativa promissora, mas ainda não está disponível um protocolo padrão que demonstre resultados consistentes. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a aplicabilidade de polímeros sintéticos na criopreservação por vitrificação de tecido ovariano bovino. Ovários bovinos foram obtidos a partir de animais abatidos para consumo em um abatedouro local. O córtex foi extraído e cortado em fragmentos. Os fragmentos foram divididos em três grupos (controle fresco, vitrificação com (CP) e sem (SP) adição de polímeros sintéticos). Os fragmentos de tecido de todos os grupos antes e após aquecimento foram fixados em paraformaldeído a 4%, corados com hematoxilina e eosina para avaliação de morfologia, contagem e observação do estágio folicular. Parte dos fragmentos tiveram seus folículos secundários isolados mecanicamente e cultivados em matriz de alginato até atingirem o estágio antral. Durante o cultivo, para análise de viabilidade, foram avaliados a sobrevida, crescimento e formação de antro folicular. Para avaliação da funcionalidade folicular, o meio de cultivo foi coletado para posterior dosagem de esteróides ovarianos. Então, os três grupos foram comparados estatisticamente. Os tecidos ovarianos vitrificados apresentaram uma morfologia com sinais de injúria, com espaços vazios e menos densos, além de exibirem uma menor porcentagem de folículos normais quando comparados ao tecido fresco (Fresco x CP p<0,0001; Fresco x SP p=0,0004). Contudo, não foi observada diferença entre os grupos vitrificados com e sem polímeros (CP x SP p = 0,7173). Os folículos que passaram pela vitrificação apresentaram uma sobrevida similar entre si e menor que o controle fresco (χ²(2) = 19,87; p< 0,0001). Todos os grupos avaliados foram semelhantes na taxa de formação de antro (χ²(1) = 0,6569; p< 0,4176). Em todos os grupos houve crescimento folicular durante o cultivo. No entanto, os folículos frescos e com adição de polímeros aumentaram de diâmetro durante todo o cultivo, ao passo que os folículos sem adição de polímeros cresceram apenas na primeira semana. No fim do cultivo, os folículos que passaram pelo processo de vitrificação produzem menos hormônios que os frescos (p < 0,05), mas sem diferença entre SP e CP. A partir desses resultados, é possível concluir que a combinação do uso de polímeros sintéticos na vitrificação de tecido ovariano é uma técnica promissora, que poderá proteger o desenvolvimento folicular, mas são necessários mais estudos que possam aperfeiçoar esse protocolo.

ABSTRACT

The preservation of fertility in cancer patients aims to ensure reproductive health. Ovarian tissue cryopreservation is the only technique available for prepubescent girls and for cases where treatment cannot be delayed. The vitrification technique is associated with better preservation of ovarian cortex fragments when compared to slow freezing. Preliminary studies in the cortex of monkeys' ovaries have shown that the combination of synthetic polymers in vitrification is better to preserve the tissue and secondary follicles, as they are mimetic to the natural proteins responsible for the protection during the winter in some organisms. The vitrification technique associated with synthetic polymers is a promising alternative, but a standard protocol that demonstrates consistent results is not yet available. Thus, this work aimed to evaluate the applicability of synthetic polymers in cryopreservation by vitrification of bovine ovarian tissue. Bovine ovaries were obtained at a local abattoir. The cortex was extracted and cut into fragments. The fragments were divided into three groups (fresh control, vitrification with (CP) and without (SP) addition of synthetic polymers). Tissue fragments from all groups before and after heating were fixed in 4% paraformaldehyde, stained with hematoxylin and eosin for morphology assessment, counting and observation of the follicular stage. Part of the fragments had their secondary follicles mechanically isolated and cultivated in alginate matrix until they reached the antral stage. During cultivation, for viability analysis, survival, growth and follicular antrum formation were evaluated. To evaluate the follicular functionality, the culture medium was collected for later measurement of ovarian steroids. The vitrified ovarian tissues presented a morphology with signs of injury, with empty and less dense spaces, in addition to showing a lower percentage of normal follicles when compared to fresh tissue (Fresh control x CP p< 0.0001). All groups evaluated were similar in the rate of antrum formation (χ²(1) = 0.6569; p< 0.4176). In all groups there was follicular growth during cultivation. However, fresh and polymer-added follicles increased in diameter throughout the cultivation, whereas follicles without polymer additions grew only in the first week. At the end of cultivation, the follicles that underwent the vitrification process produced less hormones than the fresh ones (p < 0.05), but there was no difference between SP and CP. From these results, it is possible to conclude that the combination of the use of synthetic polymers in the vitrification of ovarian tissue is a promising technique, which may protect follicular development, but further studies are needed to improve this protocol.