A new approach of immunotherapy against Crotalus snakes envenoming: ostrich (Struthio camelus) egg yolk antibodies (IgY-technology) / Un nuevo enfoque de inmunoterapia contra el envenenamiento de serpientes Crotalus: anticuerpos de yema de huevo de avestruz (Struthio camelus) (tecnología IgY)

ABSTRACT

Abstract Crotalid envenomation is a neglected collective health problem involving many countries in America, which need secure and inexpensive snake anti-venom treatments. Here, high antibody titers (IgY) were raised in the Ostrich (Struthio camelus) egg yolk by immunizing with the venom of Venezuelan venomous Crotalus snakes. Ostriches were immunized with a pool of venoms from common rattlesnake (Crotalus durissus cumanensis), Uracoan rattlesnake (Crotalus vegrandis), Guayana rattlesnake (Crotalus durissus ruruima) and black rattlesnake (Crotalus pifanorum). The anti-snake venom antibodies were prepared from egg yolk by the water dilution method, enriched by the addition of caprylic acid (CA) and precipitation with ammonium sulfate at 30% (W/V). The purity and molecular mass of the final product was satisfactory, yielding a single ∼ 175 kDa band in SDS-PAGE gels ran under non-reducing conditions. In the immunoblot analysis, specific binding of the antivenom was observed with most venom proteins. The LD50 was 16.5 g/mouse (825 μg/kg body weight). High titers of IgY against Crot/pool venom were shown by ELISA. The median effective dose (ED50) was 19.66 mg/2LD50. IgY antibodies neutralized efficiently the Crot/pool venom lethality. As far as we know, this is the first anti-snake venom produced in ostriches, which could make this technology an affordable alternative for low-income countries, since it is likely to produce manteniabout 2-4 g of IgY per ostrich egg. Hence, almost 400 g of IgY can be purified from only one ostrich during a year. In addition, there are enormous differences in the cost of investment in the maintenance of horses, from the points of view of infrastructure, feeding and veterinary care, in which the cost can reach USD 100 per animal per day, compared to a maintenance cost of USD 146 per month per producing bird. These results are encouraging and could easily be extrapolated to the manufacturing of other antivenoms and antitoxins as well, as they could be applied to the manufacturing of potential diagnostic tools.

RESUMEN

Resumen El envenenamiento por crotálidos es un problema de salud colectiva desatendido, que involucra a muchos países del continente americano, los cuales necesitan tratamientos seguros y económicos. En este trabajo, se obtuvieron títulos altos de anticuerpos (IgY) producidos en yema de huevo de avestruz (Struthio camelus) mediante la inmunización con el veneno de serpientes venezolanas del genero Crotalus. Se inmunizaron avestruces con una colección de veneno de serpientes de cascabel común (Crotalus durissus cumanensis), cascabel de Uracoa (Crotalus vegrandis), cascabel de Guayana (Crotalus durissus ruruima) y cascabel negra (Crotalus pifanorum). Los anticuerpos anti-veneno de serpiente se prepararon a partir de yema de huevo por el método de dilución en agua, enriquecidos mediante la adición de ácido caprílico (CA), seguido de una precipitación con sulfato de amonio al 30% (P/V). La pureza y masa molecular de los anticuerpos (IgY) se definieron mediante ensayos de SDS-PAGE nativos y las masas moleculares se establecieron electroforéticamente, obteniéndose una única banda de IgY de ∼ 175 kDa. El análisis de inmunotransferencia mostró la unión específica del antiveneno con la mayoría de las proteínas del veneno. La DL50 fue de 16,5 μg/ratón (825 μg / kg de peso corporal); Se mostraron títulos altos de IgY contra el veneno de Crot / pool mediante ELISA. La dosis mediana efectiva (DE50) fue de 19,66 mg/2 LD50. Los anticuerpos IgY neutralizaron eficazmente la letalidad del veneno de Crot / pool. Hasta donde sabemos, se trata del primer antídoto de serpiente producido en avestruces, lo que podría abaratar la producción de este tratamiento en países del tercer mundo. Ya que es probable que se obtengan alrededor de 2-4 g de IgY por huevo de avestruz. Por lo tanto, se podrían purificar casi 400 g de IgY de un solo avestruz durante un año. Asimismo, debido a las enormes diferencias en el costo de inversión en el mantenimiento de los caballos desde el punto de vista de infraestructura, alimentación y atención veterinaria, en los que el costo puede llegar a los 100 USD por día, frente a los 146 USD por mes de mantenimiento de la producción de aves. Estos resultados abren un campo terapéutico, para la fabricación de otros antivenenos contra un amplio espectro de toxinas y también como probables herramientas de diagnóstico.