Análise do padrão de metilação em genes supressores de tumor na Leucemia Mielóide Crônica

RESUMO

Leucemia mielóide crônica (LMC) é uma neoplasia decorrente da expansão clonal de células tronco hematopoiéticas pluripotentes. A característica genética da LMC é a presença da translocação (9;22), formando o cromossomo Philadélfia, que gera o gene de fusão BRC-ABL. A LMC é caracterizada por três fases distintas crônica, acelerada e crise blástica. O tratamento atual mais utilizado na LMC é o inibidor do BCR-ABL Mesilato de Imatinibe. Porém, vários pacientes tornam-se resistentes a este medicamento, tornando necessária a utilização de outros tipos de drogas. Atualmente, os mecanismos epigenéticos estão sendo relacionados com o início e a progressão de diversos tumores. Por serem alterações reversíveis, tem sido alvo de agentes capazes de restaurar a expressão gênica. Já existem estudos fase I e fase II com agentes demetilantes na LMC. Entretanto, pouco se sabe a respeito do perfil de metilação desta doença. Neste trabalho, analisamos o estado de metilação de 12 genes supressores de tumor por PCR metilação-específico (MSP) após tratamento do DNA com bissulfito de sódio em 70 pacientes com LMC, bem como a associação da metilação destes genes com a resposta ao Imatinibe. Além disso, realizamos ensaios in vitro com a droga 5-aza-2´-deoxicitidina e analisamos a relação entre sua ação demetilante e a re-expressão gênica. Nossos resultados mostraram que em 76% dos casos havia pelo menos um gene metilado. Das 80 amostras de pacientes com LMC analisadas, 56% apresentaram metilação no gene SOCS-1, 23% em CDH1, 20,78% no gene MGMT, 15% no p73, 11,7% em ER, 8% no p15INK4b, 6,4% no BNIP-3, 3,85% no RAR-β, 3,8% no SHP-1, 2,6% no SYK, e apenas 1,3% no gene p16INK4a. Nenhuma amostra apresentou metilação no gene DAP-k. Apesar de termos ncontrado metilação em todas as fases da doença, não observamos uma diferença significativa no índice de metilação nem com a metilação de algum gene específico entre as fases distintas. A metilação de nenhum dos genes estudados está elacionada com a reposta clínica e citogenética ao Imatinibe, nem com a sobrevida global destes pacientes. Ao realizar os ensaios com a droga 5-aza-2´-deoxicitidina na linhagem celular KMS-11, observamos que a droga foi capaz de reverter o processo de metilação dos genes estudados e restaurar a expressão dos genes anteriormente silenciados pela metilação. Podemos concluir que a metilação do DNA, principalmente do gene SOCS-1 é um evento freqüente na LMC. Entretanto, não está relacionada com a progressão da doença.

ABSTRACT

Chronic myeloid leukemia (CML) results from the neoplastic transformation of a hematopoietic steam cell. The hallmark genetic abnormality of CML is the presence of the “Philadelphia chromossome”, wich results from the t(9;22)(q34;q11) translocation and generates the BCR/ABL fusion gene. The treatment of CML has been revoltionized by Imatinib mesylate, a potent and selective BCR-ABL inhibitor. However, many patients are resistent or intolerants to Imatinib and untill now few effective therapeutic options exist for those cases. Epigenetic mechanisms have been associated with development and progression of many kinds of tumor and, as they are reversible, are target for new anti-tumor drugs. There are studys phase I and phase II testing demethylating agents such as Decitabine in CML patients. Nevertheless, there aren´t many studies showing the methylation profile of CML. In this present work, we analyzed the methylation status of 12 tumor supressor genes by MSP after bissulfite treatment in 70 patients with CML, as well as its association with response to Imatinib. Besides, we made in vitro studies using the demethylating agent 5-aza-2´-deoxycytidine and analysed its association with gene reexpression. Our results showed that a total of 76% of samples had at least one gene methylated. Of the 80 samples analysed, 56% showed methylation in SOCS-1, 23% in CDH1, 20,78% in MGMT, 15% in p73, 11,7% in ER, 8% in p15INK4b, 6,4% in BNIP-3, 3,85% in RAR-β, 3,8% in SHP-1, 2,6% in SYK, and only 1,3% in p16INK4a. None of them showed methylation in DAP-k. Despite our findings, we didn´t observe any diferences on the methylation index nor on the methylation status of a specific gene among the diferent phases of CML. The methylation status of the studied genes is not related to cytogenetic and clinical response to Imatinibe, nor with global survival of CML patients. The results from the tets with 5-aza-2´-deoxycytidine showed that the drug was able to revert the methylation status of the studied genes and to restore their expression. We can conclude that DNA methylation, specially of SOCS-1, is a common event on CML. However, it is not related to disease progression.