Aislamiento y caracterización de proteínas de unión a calmodulina en el Plasmodium falciparum

RESUMEN

Se detectaron en el citoplasma de P. falciparum, por Cromatografía de afinidad a calmodulina-agarosa en presencia de 0.2 mM calcio, nueve proteínas de unión a calmodulina de 135.0, 81.5, 66.0, 58.6, 45.0, 41.0, 36.5, 30.0 y 24.5 kDa que fueron eluidas con 1mM EGTA. Las mismas proteínas fueron identificadas independientemente por prueba de immunocoprecipitación de un extracto del parásito marcado con superíndice 35S-Met, usando calmodulina bovina y un anticuerpo monoclonal contra ésta. Cuando las nueve proteínas fueron sometidas a SDS-PAGE y transferidas a membrana de PVDF, ocho de ellas mantuvieron la habilidad de unirse a calmodulina biotinilada. Las proteínas fueron aisladas por Cromatografía de afindad, seguida por electroforesis preparativa e inoculadas en ratones Balb-C para producir anticuerpos monoclonales con los que se estudió su localización por Inmunofluorescencia e Inmunomicroscopia electrónica en los diferentes estadios del parásito. Igualmente se detectaron por inmunocoprecipitación dos bandas con peso mol superior a 205.0 kDa con capacidad de unión a un anticuerpo anti-espectrina. Una de las proteínas de unión a CaM (36.500) fue aislada y sometida a ruptura enzimática con tripsina, diseñandose a partir del extremo N-terminal de los fragmentos obtenidos, oligonucleótidos degenerados con los que se hizo amplificación del genoma del parásito por PCR, lográndose aislar un fragmento de 554 pb, que presentó una alta homología con la glutamato sintasa, proteína altamente relacionada con cloroplastos de algas y plantas, planteándose la probable importancia que esta proteína tiene tanto en la historia evolutiva de los aplicomplexas, como en el diseño de fármacos que permitan nuevas alternativas para elcontrol de las enfermedades ocasionadas por éste grupo de organismos