Regulaçäo da transcriçäo do gene do receptor B2 de bradicinina de rato: identificaçäo de um elemento silenciador / Transcriptional regulation of the rat bradykinin B2 receptor gene: identification of a silencer element

RESUMO

As cininas estao envolvidas em vários processos fisiológicos e fisiopatológicos relacionados à homeostase cardiovascular, inflamaçao, fluxo sanguíneo e nocicepçao. Em condiçoes fisiológicas, o receptor B2 da BK é expresso constitutivamente e medeia a maioria das açoes da BK incluindo reatividade vascular, respostas inflamatórias e proliferaçao celular. Entretanto, os mecanismos que regulam a expressao deste gene ainda sao pouco conhecidos. Neste estudo, uma seqüência de aproximadamente 5 kb da extremidade 5' do gene foi isolada e seqüenciada. Foram identificados diversos sítios de fatores de transcriçao no promotor como o GATA, SRE-1, CRE, GRE e o repressor CDP. Nove construçoes mutantes do promotor foram clonadas em vetores de gene repórter luciferase e transfectadas em células NG10815 e células musculares lisas de rato (CML-A), revelando vários elementos regulatórïos positivos (ERP) e negativos (ERN). Entretanto, as sequências regulatórias funcionaram como ativadoras ou inibidoras da transcriçao dependendo do tipo celular. Um elemento regulatório negativo de 56 pb causou diminuiçao na atividade do gene repórter em ambas as células e foi capaz de inibir o promotor heterólogo de timidina quinase, independente de orientaçao, sendo classificado como um silenciador clássico. Ensaio de modificaçao da mobilidade eletroforética (EMSA) e ensaio de ressonância de superfície (SPR) determinaram a ligaçao de proteínas no silenciador. sendo específicas para cada tipo celular. O silenciador foi dividido em três partes sendo observada a formaçao de complexos mais intensos no fragmento F2 nas células NG108-15 enquanto que nas CML-A a ligaçao de fatores de transcriçao foi exclusiva neste fragmento. Células NG108-15 tratadas com dBcAMP e diferenciadas foram utilizadas como modelo de regulaçao negativa do receptor BKB2. O RT-PCR para o receptor BKB2 com as células diferenciadas revelou uma menor quantidade de RNA mensageiro desse gene em comparaçao com as células indiferenciadas. O EMSA revelou a presença de complexos DNA-proteína mais intensos nas células NG108-15 diferenciadas, demonstrando que a regulaçao negativa do receptor ocorreu à nível transcricional causada pela maior ligaçao de fatores de transcriçao no silenciador. Desta forma podemos concluir que o receptor BKB2 apresenta um silenciador clássico em sua sequência e a regulaçao de sua transcriçao é célulaespecífica. Estudos posteriores serao necessários determinar os fatores específicos e os mecanismos ...(au)