Validação de metodologia para dosagem de porfirinas urinárias por cromatografia líquida de alta eficiência / Validation of a high performance liquid chromatography method for quantification of urinary porphyrins

RESUMO

Porfirinas são produtos originados da biossíntese do heme. As enzimas envolvidas neste processo podem ter sua atividade inibida por fatores genéticos, adquiridos ou uma combinação de ambos, acarretando um aumento sérico do substrato correspondente que será eliminado pela urina. Considerando-se a importância do diagnóstico precoce nas alterações da biossíntese do heme, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por fluorescência, sensível o suficiente para identificar cinco frações de porfirinas urinárias uroporfirina (8-carboxil porfirina), heptaporfirina (7-carboxil porfirina), hexaporfirina (6-carboxil porfirina), pentaporfirina (5-carboxil porfirina) e coproporfirina I e III (4- carboxil porfirinas). Métodos de extração por detecção espectrofotométrica não são sensíveis para este propósito. O cromatógrafo utilizado, da marca Shimadzu, é composto de duas bombas, injetor automático e detector de fluorescência (RF-535) com excitação de 400 nm e emissão de 620 nm. Foi utilizada uma coluna de fase reversa com um programa de gradiente linear. O método desenvolvido apresentou linearidade de 8,0 a 120,0 µg/L para as frações de interesse, demonstrando ser adequado na identificação e quantificação das porfirinas com diferentes grupos carboxílicos, importantes para o diagnóstico precoce e acompanhamento de porfirias.

ABSTRACT

Porphyrins are products that originate from the heme biosyntetic pathway. Enzymes that take part in this route can have their activity inhibited due to inherited/acquired or both factors resulting in increased serum heme precursor that will be eliminated in urine. Considering the importance of early detection of heme biosynthesis alterations, the purpose of this study was to establish a high pressure liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection, to detect five fractions of porphyrins uroporphyrin (8-carboxyporphyrin), heptaporphyrin (7-carboxyporphyrin), hexaporphyrin (6-carboxyporphyrin), pentaporphyrin (5-carboxyporphyrin) and coproporphyrin I and III (4- carboxyporphyrin). Extraction methods with spectrophotometric detection are not sensitive enough for this purpose. The HPLC (Shimadzu Co., Kioto, Japan) was composed of two high-pressure pumps, auto-sampler and fluorescence detector (RF-535) with excitation at 400 nm and emission at 620 nm. The sample was eluted from a reversed-phase column with a linear gradient. The linearity of the method was from 8.0 to 120 µg/L for all fractions, proving its ablility to identify and quantify porphyrins with differents carboxylic groups for early diagnosis and follow-up of porphyrias.